猪渗出性皮炎病原的分离鉴定及间接ELISA检测方法的研究

论文摘要

猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）是小猪渗出性皮炎的病原。渗出性皮炎典型病例表现为哺乳猪和断奶仔猪的一种急性和超急性传染病,患猪全身性皮炎可导致腹水和死亡。5-6周龄的小猪通常在感染后4-6d发病。临床症状为皮肤发红且皮肤排出物增多,在腋部和肋部出现薄的、灰棕色片状渗出物,3-5d扩展到全身各处,其颜色很快变化并富含脂质。食欲不振和脱水是本病的特征。目前,我国对渗出性皮炎的报道只限于其病原菌的分离鉴定和抗生素治疗,而对该病的病原学、发病机理及诊断方法等方面的研究尚处于空白。应用细菌分离鉴定、药敏实验等检测方法耗时费力,而间接ELISA检测方法的建立能快速、批量地进行抗体检测,达到渗出性皮炎流行病学调查的目的。本研究对渗出性皮炎的病原进行分离鉴定,利用PCR技术扩增猪葡萄球菌表皮脱落毒素基因,通过连接、转化、酶切等方法构建了表皮脱落毒素的体外表达系统,重组菌命名为pET32a-ExhB,IPTG诱导表达,用表达蛋白作包被抗原,进行间接ELISA抗体检测方法的摸索。结果表明,所分离菌株shgd1是渗出性皮炎的病原,扩增的表皮脱落毒素基因与GENE BANK中发表序列的同源性为98%,成功构建表皮脱落毒素的原核表达系统,使重组菌在大肠杆菌中成功表达,经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析,融合蛋白分子量为30ku,初步建立检测猪葡萄球菌抗体的间接ELISA诊断方法,为渗出性皮炎抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 渗出性皮炎的研究进展
• 1.1 病原学
• 1.2 流行病学
• 1.3 发病机理
• 1.4 临床症状
• 1.5 病理变化
• 1.6 诊断
• 1.7 治疗与预防
• 1.7.1 治疗
• 1.7.2 预防
• 试验研究
• 第二章 猪渗出性皮炎病原的分离与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病料来源
• 2.1.2 主要培养基及其配制
• 2.1.3 载体与质粒
• 2.1.4 主要药品与试剂盒
• 2.1.5 主要溶液的配制
• 2.1.6 主要实验器材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病原菌的分离
• 2.2.2 革兰氏染色镜检
• 2.2.3 生理生化鉴定
• 2.2.4 分离菌株的菌种保存
• 2.2.5 表皮脱落毒素的检测
• 2.2.6 表皮脱落毒素的克隆
• 2.2.7 动物回归试验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 猪葡萄球菌的分离鉴定
• 2.3.2 表皮脱落毒素的检测
• 2.3.3 动物回归试验
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 猪葡萄球菌EXHB 基因外毒素的表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 抗体
• 3.1.2 载体与菌株
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 所用溶液及其配制
• 3.1.5 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 表达用引物的设计与合成
• 3.2.2 原核表达载体的构建
• 3.2.3 重组表达菌的诱导表达
• 3.2.4 SDS-PAG 分析
• 3.2.5 溶解性判定试验
• 3.2.6 Western-blot 检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 ExhB 基因的扩增
• 3.3.2 ExhB 基因原核重组表达载体的构建与鉴定
• 3.3.3 重组质粒在大肠杆菌中表达
• 3.3.4 融合蛋白的特异性鉴定Western Blot 分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 GD 株猪葡萄球菌ExhB 基因片段的扩增
• 3.4.2 GD 株ExhB 基因高效表达重组质粒的构建
• 3.4.3 关于ExhB 基因的表达
• 3.4.4 ExhB 重组蛋白的特异性鉴定
• 3.5 小结
• 第四章 猪葡萄球菌外毒素EXHB 型抗体检测间接ELISA 方法的初步建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 主要药品及试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 融合蛋白的大量诱导表达
• 4.2.2 包涵体的纯化
• 4.2.3 间接ELISA 方法的建立
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 重组蛋白的纯化
• 4.3.2 复性后重组蛋白浓度的测定
• 4.3.3 间接ELISA 方法的建立
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介