猪睾丸组织小RNA测序、表达分析及PIWIL1基因突变检测

论文摘要

Piwi-interacting RNAs （piRNAs）是一类在雄性生殖细胞中特异性表达的非编码小分子RNA,长度为26-31nt,通过与Argonaute蛋白家族中Piwi亚家族蛋白结合发挥沉默基因、维持生殖细胞的作用。目前对于piRNAs的研究主要集中在果蝇、小鼠等小型动物群体的生殖组织及其繁殖性状方面,而对大型哺乳动物研究则较少。所以,对猪睾丸组织中piRNAs分离鉴定及功能的研究是值得探讨的一个问题。本研究主要包含了180日龄大白猪睾丸组织的Solexa deep sequencing,数据分析及候选piRNAs的筛选,实时荧光定量PCR对piRNAs、miRNAs在猪睾丸组织不同时期差异表达的验证,半定量PCR对piRNAs在猪睾丸组织中特异性表达的验证,猪PIWIL1基因的测定及多态性分析,取得的研究结果如下：1.猪睾丸组织小分子RNA的Solexa deep sequencing与生物信息学数据分析提取3头180日龄大白猪睾丸组织总RNA等量混合送深圳华大公司进行Solex a deep sequencing,产生得到的数据9,533,729条,去除1,961,666条低质量的数据,再去除5’和3’接头及其他污染,最后得到6,913,561条高质量的数据,对4,527,258条数据进行了基因组定位（在NCBI genbank/Rfam database及华大公司的genome、repeat、exon、intron、miRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、scRNA databases进行分析比对）,发现了237,590条总读数（792个单一读数）代表65猪上已证实的miRNAs,在其中14个miRNAs中发现74个SNP位点；发现了104个新的miRNAs,进行了二级结构预测及成熟序列的分析,其中47个通过与nirbase （http://w ww.mirbase.org/）的数据比对发现已经存在于其他物种中,预测其中95个miRNAs的466757个靶基因；利用piRNApredictor （http://59.79.168.90/piRNA/analysis.php）预测piRNAs并进行结果统计,通过与piRNA Database （http://pirnabank.ibab.ac.in/）数据进行比对并根据piRNAs长度、染色体特异分布等特性选取候选piRNAs。2.猪睾丸组织piRNAs、miRNAs的实时荧光定量PCR及半定量PCR验证采用茎环引物反转录的方法对候选的piRNAs与miRNAs进行克隆,成功的得到7个piRNAs和5个niRNAs的成熟序列,对这些piRNAs、miRNAs进行了实时定量荧光PCR的验证来检测它们在60日龄和180日龄大白猪和梅山猪睾丸组织中的差异表达,发现pi002142、pi 004234、pi021297、pi017724、pi0061545、pi004153、m00713p在大白猪与梅山猪60日龄和180日龄中均呈现上调表达趋势,pi021297、pi017724、pi004153、mi507、mi5085p、m01023p、m-00713p在60日龄的大白猪与梅山猪中表达量差异显著,pi0022572在180日龄的大白猪与梅山猪中表达量差异显著。通过半定量PCR发现7个piRNAs均在睾丸组织中高表达,且piR021297、piR017724是在睾丸组织中特异表达的。3.PIWIL1基因的测定及多态性分析根据已有的NCBI数据库中人和小鼠的PIWILl的序列与家猪EST数据库比对拼接,设计引物,扩增得到了一条长度为2376bp的猪PIWIL1基因序列,与人PIWIL1的序列比对相似性达91%。通过比较测序发现在第7外显子上发现一处T/C突变,运用PCR-RFLP在大白猪（476头）、中国瘦肉猪新品系DIV（131头）、皮特兰（33头）、杜洛克（29头）、白色杜洛克（31头）、梅山猪（20头）、淮南猪（26头）、通城猪（37头）共8个品种中进行基因型检测,并统计基因型和基因频率的分布情况,结果表明T等位基因为优势等位基因,T等位基因频率范围是0.73-1。多态性与繁殖性状进行关联分析,结果表明各种基因型繁殖性状差异均不显著,但CC型的繁殖性状有高于TT型与TC型的趋势。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 非编码小RNA简介
• 2.1 小干扰RNA（small interfering RNAs,siRNAs）
• 2.2 微小RNA（microRNAs,miRNAs）
• 2.3 与Piwi蛋白互作小RNA（Piwi-interacting RNAs,piRNAs）
• 2.3.1 piRNAs的发现与命名
• 2.3.2 piRNAs的特征
• 2.3.3 piRNAs的形成及调控机制
• 2.3.4 piRNAs的分离鉴定等研究现状
• 2.4 内源性小干扰RNA（endogenous small interfering RNAs,esiRNAs）
• 2.4.1 反式作用小干扰RNA（trans-acting siRNAs,tasiRNAs）
• 2.4.2 重复相关干扰小RNA（repeated-associated siRNAs,rasiRNAs）
• 2.5 其他非编码RNA
• 2.6 非编码Small RNA的研究方法
• 2.6.1 传统克隆技术
• 2.6.2 实时荧光定量PCR技术
• 2.6.3 微列阵芯片技术
• 2.6.4 Solexa深层测序技术
• 2.6.5 生物信息学分析
• 第二章 目的与意义
• 第三章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 试验样品
• 1.1.1 组织样品
• 1.1.2 DNA样品
• 1.1.3 载体和菌株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂及试剂盒
• 1.4 常用试剂及配制
• 1.5 应用到的生物信息学网站及分析软件
• 2 试验方法
• 2.1 猪睾丸组织的总RNA的提取及质量检测
• 2.1.1 猪睾丸组织的总RNA的提取
• 2.1.2 总RNA的质量检测
• 2.2 Solexa上样测序、数据的产生及生物信息学数据分析
• 2.3 候选piRNAs及miRNAs的序列验证
• 2.3.1 总RNA去除基因组污染
• 2.3.2 茎环引物反转录cDNA第一链的合成
• 2.3.3 cDNA检测
• 2.3.4 piRNAs及miRNAs成熟序列扩增引物及茎环反转录特异引物设计
• 2.3.5 piRNAs及miRNAs成熟序列的扩增
• 2.3.6 piRNAs及miRNAs成熟序列的克隆鉴定
• 2.4 实时定量法对piRNAs与miRNAs的表达验证
• 2.5 半定量法检测类piRNAs组织表达特异性
• 2.6 猪基因组DNA的提取
• 2.7 PIWIL1序列测定及多态性检测
• 2.7.1 PIWIIL1序列的测定
• 2.7.2 PIWIL1多态性检测
• 第四章 结果与分析
• 1 猪睾丸组织总RNA提取的质量检测及cDNA检测结果
• 1.1 总RNA浓度的测定
• 1.2 总RNA完整性的检测结果
• 2 Solexa测序及生物信息学分析结果
• 2.1 数据产生统计
• 2.2 18-30 nt的Small RNA的长度分布
• 2.3 Small RNA在基因组上的分布
• 2.4 Small RNAs与exon、intron、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息
• 2.5 预测的miRNAs的碱基分布特征
• 2.6 Small RNAs与重复序列的比对分布结果
• 2.7 小RNA按长度的分布的统计结果
• 2.8 piRNAs预测的统计结果
• 2.9 miRNAs的SNP统计结果
• 3 cDNA检测结果
• 4 piRNAs及miRNAs成熟序列的扩增结果
• 5 piRNAs与miRNAs的实时定量PCR结果
• 6 piRNAs的组织表达特异性表达的半定量验证
• 7 猪基因组DNA的提取结果
• 8 PIWIL1序列测定及多态性检测的结果
• 8.1 PIWIL1序列测定结果
• 8.2 PIWIL1的多态性检测结果
• 8.2.1 T64C位点AatⅡ-RFLP分型方法的建立
• 8.2.2 T64C位点在不同猪种中的基因型和基因频率的分布结果
• 8.2.3 T64C位点与猪繁殖性状的关联分析结果
• 第五章 讨论
• 1 关于Solexa deep sequencing数据分析
• 1.1 Solexa deep sequencing数据的整体统计
• 1.2 Small RNAs的染色体分布与基因组定位
• 1.3 rasiRNAs与重复序列
• 1.4 piRNAs的预测结果
• 1.5 新的miRNAs与靶基因预测
• 1.6 miRNAs与SNP位点
• 2 关于茎环引物的设计
• 3 关于小分子非编码RNA在不同发育阶段中表达情况
• 4 关于小分子非编码RNA组织表达
• 5 关于PIWIL1基因
• 6 不足之处及下一步计划
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录