OSP-1启动子及与CMV结合的双启动子真核表达载体在奶山羊卵巢壁颗粒细胞中的表达与鉴定

论文摘要

中国是世界上奶山羊生产大国,近几年国内外的山羊奶消费热激发了业内专家对高产奶羊品种选育的高度关注。我国是养殖大国也是人口大国,随着畜牧业的快速发展,人畜争粮问题也日益严峻,因此,大力发展节粮环保和优质高效的奶山羊产业,对于转变我国奶业发展方式,促进奶业的可持续发展具有重要意义,而有效增加母羊胎产羔数和产后成活数不仅可以显著提高生产效益,而且可以促使我国的养羊业可持续发展。但由于多年以来,对奶山羊品种的繁殖性状缺乏有效的系统选育,致使产羔率下降到150%左右,因此,急需进一步选育提高奶山羊的产羔性能。为了快速提高奶山羊的产羔性能,必须尽快的把现代生物技术应用到奶山羊的产羔性状育种上来,最大程度上解决制约了奶羊业的快速发展的生产瓶颈问题。卵巢是动物繁殖中最重要的器官,且颗粒细胞在维持奶山羊繁殖功能上发挥着非常重要的作用,筛选和研究调控卵泡颗粒细胞内与产羔性能密切相关的功能基因表达的特异性启动子是当前动物生殖科学研究的热点之一。目前发现的卵巢组织中特异性的启动子有OSP-1、OSP-2 （卵巢组织特异性启动子）,而这些启动子能否有效的调控奶山羊卵巢组织中与产羔数相关的功能基因的特异性表达还缺乏试验证明。本试验旨在筛选和研究适合于调控奶山羊卵巢组织的特异性启动子,以便通过基因工程等分子生物学技术探索调控奶山羊卵泡形成、成熟,以及维持卵巢功能等的功能基因对于奶山羊排卵数、受精率和产羔数的影响,进而为奶山羊的分子育种繁殖工作提供一个可行的方法。本研究采用卵巢特异性启动子表达载体的构建、卵泡颗粒细胞分离培育、脂质体转染、实时定量PCR检测等实验方法,分析OSP-1的卵巢组织特异性及双启动子调控报告基因在卵巢组织中的表达效率,试验结果如下:1、设计并克隆了卵巢特异性启动子（OSP-1）。构建了三种含有不同启动子的EGFP （报告基因）载体:pCMV-EGFP （巨细胞病毒启动子报告基因载体）、pOSP1-EGFP （卵巢特异性启动子的报告基因载体）、pCMV-OSP1-EGFP（巨细胞病毒启动子和卵巢特异性启动子报告基因载体）。2、使用机械分离法,成功分离培养得到奶山羊卵泡颗粒细胞。原代贴壁的奶山羊卵泡颗粒细胞大部分为梭形或者不规则多边形。刚开始接种后,细胞呈悬浮的球型状;随着培养时间的增加,细胞开始接触、贴壁,同时有彼此接近运动并出现细胞团的现象;继续培养发现,细胞团底部贴壁的伪足相互接触;大约培养5-6天后,可铺满培养皿底部,形成颗粒细胞单层。3、将pOSP1-EGFP转染到奶山羊卵泡颗粒细胞、乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞及人卵巢癌细胞系HO-8910。通过倒置荧光显微镜观察和实时定量PCR鉴定,只在奶山羊卵泡颗粒细胞和人卵巢癌细胞系HO-8910中检测到EGFP的表达,表明pOSP1-EGFP在卵巢组织中有表达转录活性。4、分别将含有OSP-1、CMV和CMV-OSP1双启动子的EGFP表达载体转染不同细胞,采用实时定量PCR检测不同启动子调控下EGFP在不同细胞中的表达效率,结果显示:在卵泡颗粒细胞中,pCMV-OSP1-EGFP组EGFP的相对表达量分别比单启动子组pOSP1-EGFP、pCMV-EGFP提高了29%（ p<0.05）、51.22%（ p <0.05）;在人卵巢癌细胞系HO-8910中,pCMV-OSP1-EGFP组EGFP的相对表达量分别比单启动子组pOSP1-EGFP、pCMV-EGFP提高了21%（ p <0.05）、44.07%（ p <0.05）。表明增加启动子数目可以有效地提高外源基因的表达效率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 奶山羊产羔性状分子育种的研究进展
• 1.1 西农萨能奶山羊品种简介
• 1.2 现代生物技术的应用
• 1.2.1 性别控制技术
• 1.2.2 分子标记的应用
• 1.2.3 转基因动物技术的应用
• 第二章 启动子的研究进展
• 2.1 启动子
• 2.2 常用启动子
• 2.3 卵巢特异性启动子
• 2.4 双启动子研究进展
• 第三章 实时定量PCR 技术及其在动物研究中的应用
• 3.1 实时定量PCR 技术的背景
• 3.2 实时定量PCR 技术原理
• 3.3 实时定量PCR 技术的标记方法
• 3.3.1 Taqman 探针
• 3.3.2 内嵌染料
• 3.3.3 分子信标
• 第四章 本研究的目的及意义
• 第二篇 试验研究
• 第五章 不同启动子表达载体的构建与鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.1.1 试验样品
• 5.1.1.2 主要仪器设备
• 5.1.1.3 试验主要试剂和载体等
• 5.1.2 试验方法
• 5.1.2.1 载体构建图
• 5.1.2.2 目的基因片段的克隆
• 5.1.2.3 pCMV-EGFP 载体构建
• 5.1.2.4 pOSP1-EGFP 载体的构建
• 5.1.2.5 pCMV-OSP1-EGFP 载体的构建
• 5.1.2.6 质粒的大量提取
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 目的基因片段的克隆
• 5.2.2 pCMV-EGFP 载体的构建
• 5.2.3 pOSP1-EGFP 载体的构建
• 5.2.4 pCMV-OSP1-EGFP 载体的构建
• 5.3 讨论
• 5.3.1 关于引物设计
• 5.3.2 关于PCR 扩增
• 5.3.3 关于OSP-1 启动子
• 5.4 小结
• 第六章 奶山羊卵泡颗粒细胞的分离培养
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.1.1 试验样品
• 6.1.1.2 主要仪器设备
• 6.1.1.3 主要试验试剂
• 6.1.2 试验方法
• 6.1.2.1 奶山羊卵泡颗粒细胞的采集和原代培养
• 6.1.2.2 奶山羊卵泡颗粒细胞的传代培养
• 6.1.2.3 奶山羊卵泡颗粒细胞的冻存
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 奶山羊卵泡颗粒细胞原代培养观察
• 6.2.2 奶山羊卵泡颗粒细胞传代培养观察
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 不同启动子表达载体的转染与鉴定
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 试验材料
• 7.1.1.1 试验样品
• 7.1.1.2 主要仪器设备
• 7.1.1.3 主要试剂和载体
• 7.1.2 试验方法
• 7.1.2.1 各组织细胞的复苏与传代
• 7.1.2.2 转染各组织细胞
• 7.1.2.3 实时定量PCR 鉴定
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 荧光检测pOSP1- EGFP 在各组织细胞中的表达
• 7.2.2 实时定量PCR 鉴定
• 7.3 讨论
• 7.3.1 关于实时定量PCR
• 7.3.2 关于OSP-1 启动子的特异性表达
• 7.3.3 关于双启动子的转录活性
• 7.4 小结
• 主要结论
• 本研究的创新点
• 进一步研究的问题
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介