槲皮素抑制大鼠脑胶质瘤增殖作用的体内实验研究

论文摘要

目的:恶性胶质瘤发生于神经外胚层,是颅内最常见的原发性肿瘤。对于该肿瘤,手术是目前首选的治疗方法,但因其侵润性生长的特性,肿瘤与周围组织边界不清,使得胶质瘤不能够根治性切除,75%以上的胶质瘤患者术后一年内复发并死亡,病死病残率极高。因此化学治疗作为恶性肿瘤治疗的主要手段之一,是脑胶质瘤治疗的重要补充并在颅内胶质瘤的治疗中具有不可替代的地位。目前胶质瘤的常规化疗药物,毒性大且容易造成中枢神经系统甚至全身的毒副作用,在有效通过血脑屏障方面也有一定限制,而使得胶质瘤对化疗药物反应性低,化疗疗效不理想,因此在临床的应用方面受到了一些限制,故寻求一种高效低毒的杭胶质瘤药物有重要意义。槲皮素作为一种黄酮类化合物,对多种肿瘤的抑制增殖作用的研究表明,它是目前最强的抗肿瘤药物之一,它毒性低,是人类饮食中最主要的的生物类黄酮,对于它抗肿瘤机制的的研究表明它的功能是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等实现抗肿瘤作用。本实验探讨了槲皮素对大鼠脑胶质瘤模型的抑瘤作用及治疗前后肿瘤细胞增殖活性的变化及其机制,并为肿瘤的治疗提供可能的手段和方向。方法:1、SD大鼠脑胶质瘤模型建立:体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,对大鼠C6胶质瘤细胞株进行复苏,加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中进行培养后,取对数生长期的C6胶质瘤细胞,消化、吹打均匀并计数,制成细胞悬液。接种前采用台盼蓝据染法测定细胞存活率达95%以上。微量注射器抽取10μl细胞悬液,其中含有约1.0×106C6细胞,接种部位为大鼠右侧尾状核。接种后10天,行强化头部MRI检查,确定目标部位有肿瘤形成,模型制作成功。2、将模型鼠随机分为四组,每组分别给予相应治疗措施:对照组腹腔内注射二甲基亚砜（DMSO）0.2ml,生理盐水1ml,每天一次,共七次;顺铂组:腹腔内注射DMSO 0.2ml,顺铂1mg/kg（溶于1ml生理盐水）,每天一次,共七次;槲皮素组每天腹腔内注射槲皮素50mg/kg（溶于0.2mlDMSO）,生理盐水1ml,每天一次,共七次。槲皮素+顺铂组每天上午腹腔内注射槲皮素50mg/kg（溶于0.2mlDMSO）,每天下午腹腔内注射顺铂1mg/kg（溶于1ml生理盐水）,共七次;3、行为学变化观察及再次行MRI检查。断头处死大鼠并固定肿瘤标本,计算肿瘤体积及抑瘤率。肿瘤标本透射电子显微镜检测。采用HE染色、光镜、电镜等方法,对比观察分析肿瘤的形态学变化。应用免疫组织化学方法检测应用抑胶素前肿瘤中增殖细胞核抗原（PCNA）表达,探讨槲皮素对肿瘤细胞增殖活性的影响。4、应用SPSS 11.0统计软件,采用方差分析以及t检验进行统计学处理,统计结果以P<0.05为有显著差异。结果:胶质瘤模型建立成功有效,大鼠颅内均有肿瘤生长。各实验组大鼠均较对照组大鼠生存状态为佳,生存期延长,平均生存期分别为23天、25天与27天。槲皮素治疗效果明显,对C6胶质瘤细胞生长具有明显的抑制作用。顺铂组、槲皮素组与槲皮素+顺铂组均有一定地抑瘤作用,以后两者的抑瘤作用较强,肿瘤体积较对照组明显缩小。采用MRI增强扫描能较好的反应颅内C6胶质瘤生长情况。MRI影像扫描显示:肿瘤均匀强化,边界清楚,同侧脑室受压,中线结构移位明显。治疗后各组与对照组影像对比,肿瘤体积增大不明显,明显受抑制。肿瘤大体组织标本观察,肿瘤占据右侧大脑半球大部,向周围组织侵润生长,可见大片坏死液化组织。测量肿瘤体积,对照组平均体积为101.1±9.6mm3,余治疗组体积小,顺铂组为66.2±5.9mm3,计算该组抑瘤率为34.8%,与对照组体积变化差异有显著性意义（P<0.01）;槲皮素组和槲皮素+顺铂组肿瘤体积分别为59.6±5.4mm3,53.5±4.2mm3,分别计算抑瘤率为41.3%和47.3%,于对照组体积变化差异均有显著性意义（P<0.01）。组间比较顺铂组与槲皮素组（P<0.05）和槲皮素+顺铂组（P<0.01）肿瘤体积变化也都有显著性差异,而槲皮素组和槲皮素+顺铂组相比差异也具有显著性（P<0.05）。光镜下观察,对照组的瘤细胞生长活跃密集成群,瘤细胞异型性明显,体积大,胞质红染,细胞核大深染,核分裂像多见,少数细胞可见核固缩、浓染。治疗后可见瘤细胞数量明显减少,肿瘤细胞坏死,可见大量的凋亡细胞,核分裂象较少见,亦可见坏死的细胞及出血灶。电镜下的观察发现C6细胞在处理后细胞发生皱缩,核染色质固缩并分离,细胞质浓缩,细胞膜和核膜皱曲,核断裂形成片段,最后形成数量不等的凋亡小体。PCNA免疫组化结果分析,PCNA阳性细胞的胞核呈黄色或棕黄色,对照组肿瘤细胞明显表达PCNA,表现为阳性细胞密度高,胞核呈强阳性。经治疗后即可见肿瘤内PCNA阳性细胞密度下降,核PCNA阳性强度减弱。结论:本实验证实槲皮素能显著抑制肿瘤生长,明显延长生存期;应用MRI、光镜、电镜以及免疫组化法检测PCNA表达,显示经槲皮素治疗后可见肿瘤体积缩小、肿瘤细胞凋亡发生、PCNA阳性细胞密度下降,核PCNA阳性强度减弱。以上研究结果证实了槲皮素能够抑制大鼠颅内C6胶质瘤细胞的生长,其作用机制可能与诱导胶质瘤细胞发生凋亡及抑制肿瘤细胞增殖有关。它为以后的进一步临床研究提供了实验依据及理论基础。

论文目录

• 中文摘要
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• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述 槲皮素在脑胶质瘤治疗中的研究进展
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