稻瘟菌四个致病相关突变位点的定位及侵染钉缺陷突变体的初步研究

论文摘要

由稻瘟菌（Magnaporthe grisea）引起的稻瘟病是重要的水稻病害之一。以研究稻瘟菌致病基因为中心,探讨致病相关基因的种类及其功能,生理小种和致病基因的关系,致病基因的遗传分离和在群体中的转移规律等等,能够为水稻抗瘟性研究和稻瘟病化学防治、生物防治提供理论基础。本研究利用在实验室已经建成的根癌农杆菌介导的稻瘟菌T-DNA插入突变体库,挑选了7个致病力缺陷的突变体,提取基因组DNA,PCR检测确认T-DNA的插入。利用DW-ACP-PCR（DNA Walking-Annealing Control Primer-PCR）技术对T-DNA右边界侧翼序列进行扩增,7个突变体都获得了特异条带。对这些特异条带进行克隆并测序,其中5个克隆测序成功,另外2个测序失败。将成功克隆的序列与稻瘟菌基因组和NCBI数据库比对,发现1个为载体pCAMBIA1300序列,4个与稻瘟菌的基因组相似性达93%～99%,认为是T-DNA插入位点的侧翼序列。具体如下:①突变体Y34-0144:T-DNA插入在稻瘟菌IV号染色体5.187超级重叠群中1883321bp处。位于两个反向假定蛋白编码基因MG12157.5和MG04131.5间。②突变体Y34-0178:T-DNA插入在稻瘟菌未标注染色体5.139超级重叠群33793bp处,位于预测蛋白编码基因MG14318.5上游473bp。③突变体Y34-0453:T-DNA插入在稻瘟菌Ⅱ号染色体5.184超级重叠群中403890bp处,位于该超级重叠群中假定蛋白编码基因（MGG 02065.5）下游1773bp。④突变体Y34-0619:T-DNA插入在稻瘟菌Ⅱ号染色体5.184超级重叠群中403789bp处,位于该超级重叠群中假定蛋白编码基因（MGG 02065.5）下游1874bp处。对明确T-DNA插入位点的突变体Y34-0453进行致病性丧失原因的探讨。研究表明,Y34-0453在燕麦培养基上的长势比Y34的弱,气生菌丝减少,菌落颜色为黄褐色,释放到培养基的黑色素也减少。其菌落生长速度、分生孢子形态、附着胞形态、分生孢子萌发率、附着胞形成率与Y34相比无显著差异,但是产孢量极显著增加,接种洋葱表皮没有观察到侵染钉的形成。Y34-0453喷雾接种水稻感病品种,不发病。但是,接种擦伤过的叶片发病程度与野生菌株一致。说明Y34-0453不能有效穿透寄主叶表面,但是在寄主叶面存在伤口的情况下可以侵入并发展侵染菌丝定殖。设计一对引物对突变体Y34-0453 T-DNA的部分序列以及其侧翼的稻瘟菌基因组序列进行扩增,得到预期大小的片段,验证了Y34-0453的T-DNA插入位点。提取突变体Y34-0453和野生菌株Y34总RNA,反转录合成cDNA第一链,并设计特异引物进行RT-PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction）,验证Y34-0453 T-DNA插入位点下游假定蛋白编码基因（MGG 02065.5）是否表达。野生菌株Y34扩增到了特异条带,而突变体Y34-0453没有扩增到任何条带。说明突变体Y34-0453可能是由于T-DNA的插入,中断了其附近的MGG 02065.5基因的表达。综合这两方面的探讨,初步认为,Y34-0453致病力丧失的原因是不能分化出侵染钉。假定蛋白编码基因（MGG 02065.5）可能调控侵染钉的分化,但是对侵入菌丝的扩展没有影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 稻瘟菌的生物学特性
• 1.2.1 稻瘟菌的生活史
• 1.2.2 侵染过程以及致病机制
• 1.2.3 稻瘟菌的生理小种
• 1.3 稻瘟菌致病相关基因研究策略
• 1.3.1 正向遗传学策略
• 1.3.1.1 转座子介导的插入突变
• 1.3.1.2 限制性内切酶介导的整合技术
• 1.3.1.3 根癌农杆菌介导的遗传转化
• 1.3.2 反向遗传学策略
• 1.3.2.1 基于基因同源性的克隆法
• 1.3.2.2 基于蛋白质的克隆法
• 1.4 稻瘟菌致病相关基因克隆的研究进展
• 1.4.1 分生孢子生长发育基因
• 1.4.2 附着胞形成基因
• 1.4.3 侵入过程和侵入菌丝扩展的基因
• 1.4.4 编码其他致病生化因子的基因
• 1.5 获得T-DNA 侧翼序列的方法
• 1.6 本研究的目的意义和研究内容
• 1.6.1 目的意义
• 1.6.2 研究路线
• 2 DW-ACP-PCR 技术定位稻瘟菌突变体T-DNA 插入位点
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物设计
• 2.1.4.1 突变体T-DNA 分子检测引物
• 2.1.4.2 DW-ACP-PCR 引物
• 2.1.4.3 菌液PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 稻瘟菌基因组提取
• 2.2.1.1 大量菌丝的获得
• 2.2.1.2 稻瘟菌基因组DNA 的提取
• 2.2.2 T-DNA 插入的分子检测
• 2.2.2.1 质粒pBHt2 的提取
• 2.2.2.2 PCR 检测突变体T-DNA 的插入
• 2.2.3 突变体T-DNA 插入侧翼片段分离
• 2.2.4 T-DNA 插入侧翼片段的克隆
• 2.2.4.1 目标片段回收
• 2.2.4.2 E.coli DH5α的感受态细胞的制备
• 2.2.4.3 目标片段与载体连接
• 2.2.4.4 连接产物转化 E.coli DH5α的感受态细胞
• 2.2.4.5 重组质粒鉴定（菌液PCR）
• 2.2.4.6 测序以及序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 致病相关突变体基因组DNA 的提取结果
• 2.3.2 T-DNA 插入的分子检测结果
• 2.3.3 DW-ACP-PCR 扩增得到 T-DNA 插入位点的侧翼序列
• 2.3.4 DW-ACP-PCR 产物的克隆与重组子的验证结果
• 2.3.5 目标片段的测序与分析结果
• 3 Y34-0453 突变体的致病性丧失原因初探
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 生化试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 Y34－0453 致病性丧失的生物学分析
• 3.2.1.1 菌落生长速度测定
• 3.2.1.2 产孢量测定
• 3.2.1.3 孢子萌发和附着胞形成的观察
• 3.2.1.4 侵染钉形成的观察
• 3.2.1.5 两种接种方法致病性比较
• 3.2.1.6 有性交配分析
• 3.2.2 突变体Y34-0453 致病性丧失的分子生物学研究
• 3.2.2.1 T-DNA 插入位点的分子验证
• 3.2.2.2 突变体 Y34-0453 以及野生菌株 Y34 的总 RNA 的提取
• 3.2.2.3 cDNA 第一链合成
• 3.2.2.4 RT-PCR 检测T-DNA 插入位点下游基因的表达
• 3.2.2.5 RT-PCR 产物的克隆和测序
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Y34－0453 致病性丧失的生物学分析结果
• 3.3.1.1 菌落生长速度
• 3.3.1.2 产孢量的比较结果
• 3.3.1.3 分生孢子萌发和附着胞形成的观察结果
• 3.3.1.4 侵染钉形成的观察结果
• 3.3.1.5 两种接种方法比较致病性的结果
• 3.3.1.6 有性交配分析结果
• 3.3.2 突变体Y34-0453 致病性丧失的分子生物学研究
• 3.3.2.1 T-DNA 插入位点分子验证
• 3.2.2.2 Y34-0453 以及Y34 的总RNA 的提取
• 3.2.2.3 RT-PCR 检测T-DNA 插入位点下游基因的表达
• 3.2.2.4 RT-PCR 产物的克隆、测序和分析
• 4 讨论
• 4.1 关于T-DNA 整合到宿体基因组的问题
• 4.2 关于DW-ACP-PCR 技术
• 4.3 关于突变体Y34-0453 的表型分析
• 4.4 关于RT-PCR 检测突变体Y34-0453 T-DNA 插入位点邻近基因的表达
• 4.5 有待进一步研究的问题
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢