论文摘要
第一部分ABO常见等位基因相关NPs的模板筛选目的：筛选出携带5个ABO等位基因相关的NPs（261,467,802,803,1061）的正常及突变纯合子和/或杂合子,为后续嵌合体分析方法的建立及方法学评价提供合适的研究模板。方法：收集76例体检者血样,用抗-A、抗-B、抗A,B、抗A1、抗H和ABO反定红细胞进行ABO血型鉴定,要求正反定型一致,非孟买型,其中A 18人,B 27人,0 18人,AB 13人；抽提全血基因组DNA,设计5个NPs相应的引物及PCR-SSP扩增体系进行分析。结果：筛选到的5个NPs按血型分布如下：A（261杂合子、467正常纯合子）有7例,A（261杂合子、467杂合子、1061正常纯合子）有8例,A（261正常纯合子、467杂合子、1061正常纯合子）有3例；B（261杂合子、803杂合子）有23例,B（803突变纯合子）有4例,O（均为261突变纯合子）18例,AB（467杂合子、803杂合子、1061正常纯合子）有10例,AB（467正常纯合子、803杂合子）有3例,未能筛选出467突变纯合子,802杂合子或突变纯合子,1061杂合子或突变纯合子。结论：直接在表型确定的DNA标本进行NPs筛选而不需要进行基因分型是可行的,但受到筛选群体量及种群的ABO基因频率限制,我们无法获得467正常位点对应的阴性模板,802及803正常及突变位点对应的阳性模板或阴性模板,因此这些位点均不能进入ABO基因相关NPs SYBR green I实时荧光定量PCR方法的研究及方法学评价。第二部分建立NBO基因相关NPs SYBR green I实时荧光定量PCR方法目的：建立检测261突变位点、261正常位点、467突变位点,803突变及正常位点的SYBR green I实时荧光定量PCR反应体系。方法：以研究第一部分筛选到的261,467,803位点的模板为研究对象,分别建立依赖相应的正常及突变位点SYBR green I实时荧光定量PCR,包括白蛋白基因内参体系的建立,PCR反应体系的建立和设计最优的人为增加错配扩增引物。对各位点的扩增产物进行融解曲线分析及电泳分析,各位点阴阳模板的ACt值综合确定最优的人为增加错配扩增引物,再对其扩增产物通过测序分析来证实特异性。结果：建立的白蛋白基因内参体系标准曲线的回归方程为：y=-3.04x+33.95,相关系数为1.00,此外在500ng和7.81ng时平均Ct值分别达到18.26和23.66；261突变位点的最佳引物为：261mut-260mismatch（T→C）,其阴阳模板的△C t为：14.38；261正常位点的最佳引物为：261nor-260mismatch（T→C）,其阴阳模板的△C t为：11.22；467突变位点的最佳引物为：467mut-466mismatch（C→T）,其阴阳模板的△C t为：10.2；803突变位点的最佳引物为：803mut-804mismatch（G→A）,其阴阳模板的△C t为：11.5；803正常位点的最佳引物为：803nor-804mismatch（G→A）,其阴阳模板的△C t为：10.26；所有确定的最佳引物经其扩增产物测序证实与预期完全一致。结论：白蛋白基因内参体系扩增效率高,线性关系好。未知浓度模板均可以在500ng-7.81ng范围内进行有效浓度的标定。依赖261正常及突变位点、467突变位点、803正常及突变位点的SYBR green I实时荧光定量PCR均已成功建立,并具有较高的扩增效率及特异性。第三部分SYBR green I实时荧光定量PCR方法在ABO血型不合HSCT移植后嵌合体定量分析中的评价目的：评价研究第二部分建立的各位点实时定量PCR检测嵌合体的线性定量范围。方法：抽提相应261（正常纯合子、突变纯合子、杂合子）、803（正常纯合子、突变纯合子、杂合子）模板,经白蛋白基因标定浓度至20ng/μl,467（杂合子、正常纯合子）模板浓度标定至40 ng/u 1,对阳性及相应位点的阴性模板按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的10倍比例稀释制备人工混合嵌合体DNA模板,以及100%（纯阳性模板）、0%（纯阴性模板）,同步进行实时荧光定量PCR检测。扩增完毕后进行熔解曲线分析。所得的Ct值与实际稀释后所对应NPs阳性位点基因拷贝数的对数值由稀释度低到高的顺序逐点纳入回归分析,以确定各位点线性定量检测范围。结果：通过熔解曲线分析,所有位点阳性模板均扩增出特异性产物。（1）261突变纯阳/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y=-3.444x+38.83,相关系数R2为1.00；261突变杂合子/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y==-3.386x+38.31,相关系数R2为1.00；261正常纯阳/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y=-3.129x+37.51,相关系数R2为1.00；261正常杂合子/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y=-3.152x+37.66,相关系数R2为1.00；所有261位点比例稀释线性定量检测范围均至少≥10-3。（2）467突变杂合子/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y=-3.373x+41.02,相关系数R2为1.00。467位点比例稀释线性定量检测范围至少≥10-2。（3）803突变纯阳/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y=-3.183x+40.26,相关系数R2为0.99；803突变杂合子/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y=-3.244x+39.02,相关系数R2为0.99；803正常纯阳/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y=-3.162x+39.89,相关系数R2为0.99；803正常杂合子/纯阴模板比例稀释的回归方程为：y=-3.136x+38.47,相关系数R2为0.99；所有803位点比例稀释线性定量检测范围均至少≥10-2。结论：建立的ABO基因相关NPs在嵌合体定量分析中的具有较高的检测灵敏度,同时261、803杂合子阳性与纯合子阳性的线性定量检测范围无明显差异。
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