乳岩宁与三苯氧胺联合抗乳腺癌作用及其机制的研究

论文摘要

目的:乳腺癌是女性最好发的恶性肿瘤之一,我国近年来的发病率有非常明显的上升趋势。目前乳腺癌病人因为化疗、放疗、内分泌治疗、免疫治疗及手术治疗的不断发展,其死亡率开始有所下降,但仍有相当一部分病人会复发和转移。而多数晚期乳腺癌患者对二次化疗、放疗及手术已经不能忍受。因内分泌治疗乳腺癌,有着使用方便,副作用小,缓解时间长等优势,已得到绝大多数医生及病人的认可。辽宁中医药大学附属医院肿瘤科在治疗中晚期乳腺癌患者服用三苯氧胺（TAMoxifen,TAM）同时服用乳岩宁方取得了很好的疗效。乳岩宁方是在《伤寒论》的柴胡加龙骨牡蛎汤基础上加味组成,其主要功效是调畅气机、疏肝健脾、扶正抗癌、软坚散结。肿瘤的发生发展与气机出入升降失常有密切关系,可通过调理肝、肾、脾三方面来治疗恶性肿瘤所引起的各种临床症状,进而达到提高生存质量,延长生命的目的。中医认为,肝脉挟乳,气血郁滞,肝失疏泄,结于乳中,日久则乳络不畅而发“乳岩”,故古往今来治疗乳腺疾病多从肝论治。柴胡加龙骨牡蛎汤是《伤寒论》中和解少阳,理气调肝的主要用方。吾导师殷东风教授多年来总结认为,乳腺癌患者体内癌毒四处走窜,虽变证百出,但气机不畅乃贯穿始终。故乳岩宁方以柴胡加龙骨牡蛎汤为主方,以达到枢利气机、调和肝气的目的。方中柴胡为君药,与臣药黄芩相配,而使气机通达,枢机调和;生姜与半夏相配,为小半夏汤,具有辛开散结,和胃止呕,豁痰降逆,宣畅气机之功;而人参、大枣、甘草,一者取其扶正以祛邪,二者取其“见肝之病,则知肝当传之与脾,故先实其脾气”之意。加入牡蛎、龙骨以镇定安神,辅以浙贝母、山慈菇、莪术以化瘀解毒,软坚散结。纵观全方,有升有降,共奏调畅气机、疏肝健脾之功效。乳岩宁对TAM抑瘤作用及其抗肿瘤机制尚需进一步研究。因此本文选用人雌激素依赖性乳腺癌移植瘤模型,通过观察乳岩宁与TAM联合对MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌的抑瘤作用、对MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌的细胞凋亡,免疫组化方法检测裸鼠移植瘤组织MMP-2、MMP-9蛋白表达,Western blotting法检测移植瘤p38MAPK、c-fos蛋白表达水平的影响,探讨乳岩宁对乳腺癌侵袭转移的抑制作用及其可能的机制,可能与p38MAPK信号转导通路相关。材料与方法:第一部分:MCF-7荷瘤裸鼠移植模型的建立将培养好的MCF-7细胞经消化胰酶消化后,用PBS液清洗2次,再用1%台盼蓝染色,于细胞记数板上进行细胞记数,并调节活细胞浓度为1×107/ml,在无菌条件下施行裸鼠右侧胸壁第二乳垫,脂肪层下接种0.2ml/只,共接种3只,术后荷瘤裸鼠继续饲养于SPF环境中,待肿瘤长至0.8cm3时,行裸鼠间原位移植。在无菌条件下取出乳腺癌组织,剪切成1mm3左右的小块,分别移植于24只裸鼠右侧胸壁第二乳垫脂肪层下,4d后可见肿瘤生长,成瘤率100%。将24只MCF-7荷瘤裸鼠随机分为4组,每组6只。①模型组（荷瘤裸鼠）②TAM组③乳岩宁组④TAM+乳岩宁组（简称联合组）。模型组:0.9%氯化钠注射液,0.2ml/只;TAM组:为3.6mg/kg;0.2ml/只;乳岩宁组:乳岩宁1.149g/kg,0.2ml/只;联合组:TAM 3.6mg/kg+乳岩宁1.149g/kg,0.2ml/只。每日灌胃1次,连续给药28d。检测指标:①肿瘤生长曲线图:从第1次注射开始每两到三天,观察一次裸鼠的全身情况和肿瘤生长状况,无菌条件下测量肿瘤的直径,连续观察记录,并以时间为横坐标,以肿瘤的体积为纵坐标,肿瘤体积计算公式为:V=1/2×ab2,a为肿瘤长径,b为肿瘤短径,并据此绘制移植瘤生长曲线。②抑瘤率:注射药物4周后,脱颈椎处死裸鼠,将处死小鼠用动物天平称体重,再分离瘤体用电子天平称瘤重,计算抑瘤率,抑瘤率按照公式（模型组瘤重一实验组瘤重）/模型组瘤重×100%计算。③透射电镜观察细胞凋亡:以超薄切片术快速冷冻肿瘤组织,采用戊二醛和四氧化锇的双固定法将其固定,脱水、浸透、包埋、切片、透射电镜（TEM）进行超微结构水平上的观测。④肿瘤细胞凋亡率:采用TUNNEL法检测,细胞核内出现棕色颗粒者为阳性细胞,高倍视野下计数100个细胞中的阳性细胞数,每张切片随机计数5个视野,计算细胞凋亡指数（Apoptosis Inedx ,AI）,（ AI =阳性细胞数/计数的细胞个数×100%）。统计学方法采用SPSS13.0软件,单因素方差分析,统计数据以均数±标准差表示,以P<0.05为显著性差异的标准。第二部分:免疫组化法（S-P法）测定裸鼠移植瘤组织MMP-2、MMP-9的表达。用已知的阳性切片做阳性对照,用PBS溶液代替一抗做阴性对照。MMP-2、MMP-9的结果判定标准:MMP-2、MMP-9的阳性细胞为细胞膜或细胞浆中出现浅黄色至棕褐色的颗粒。其判断方法为:在镜下,根据棕色反应的阳性强度及面积判断其结果。对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别打0,1,2,3分,着色阳性面积按无着色、着色0～30%,30%～60%,60%～100%分别打0,1,2,3分,然后根据两项打分之和判断其结果:0分为阴性（-）,≥3分为阳性（+）,其中5分者为强阳性（++） （注:每张切片选择有代表性的区域,在100倍视野下进行计数,共计5个视野,取其平均值以避免随意性）。统计分析:采用SPSS13.0软件进行统计,计数资料采用均数±标准差表示,以P<0.05为显著性差异的标准。第三部分用免疫印迹（Western blotting）方法检测裸鼠移植瘤肿瘤组织p38MAPK、c-fos蛋白表达。统计分析:用扫描仪将底片上的条带的条带扫描后输入计算机,用Band Scan V5.0条带分析软件进行统计分析,各组条带的表达强度以各样本与其内参的灰度比值（相对灰度值）的平均数表示。结果:1.乳岩宁抑制裸鼠移植瘤的生长,使肿瘤体积缩小,各组瘤重分别为模型组2.25g±0.51g,TAM组1.51g±0.32g,乳岩宁组1.71g±0.39g,联合组1.33g±0.18g,各用药组与模型组比较有显著性统计学差异（P<0.05）。抑瘤率分别为TAM组32.89%,乳岩宁组24.00%,联合组40.89%,各用药组与模型组比较有显著性统计学差异（P<0.05）;联合组与TAM组及乳岩宁组相比,裸鼠的肿瘤体积均有显著性差异（P <0.05）;但TAM组及乳岩宁组之间无统计学差异（P>0.05）。2.细胞凋亡率模型组为8.66%±3.11%,TAM组为29.14%±8.18%,乳岩宁组为22.11%±7.02%,联合组为36.60%±6.71%,各用药组与模型组比较,细胞凋亡率提高,存在显著性统计学差异（P<0.05）;联合组与TAM组及乳岩宁组相比,均有显著性差异（P <0.05）;但TAM组及乳岩宁组之间无统计学差异（P>0.05）。3. MMP-2、MMP-9在模型组中的表达水平最高,分别为42.35%±5.28%、52.33%±4.76%在TAM组分别为28.39%±4.21%、27.56%±3.12%,乳岩宁组分别为31.52%±3.18%,32.14%±3.98%而在联合组的表达分别为24.36%±3.23%、22.29%±2.67%。各用药组与模型组相比较,MMP-2、MMP-9的表达水平均下降,有显著性统计学差异（P<0.05）,而TAM组及乳岩宁组对于MMP-2、MMP-9的表达无统计学差异。本实验证实了TAM及乳岩宁均可以下调MMP-2、MMP-9的表达,两组药物的作用无显著性差异（P>0.05）,两药联合应用能起到协同效应。4.组磷酸化p38MAPK蛋白在各组的表达分别为模型组1.13±0.23,TAM组0.70±0.13,乳岩宁组0.76±0.11,联合组0.58±0.18,各用药组与模型组比较,p38MAPK蛋白表达下降,存在显著性统计学差异（P<0.05）;联合组与TAM组及乳岩宁组相比,也存在显著性差异（P <0.05） , TAM组及乳岩宁组之间无统计学差异（P>0.05）。5.c-fos在各组的表达分别为模型组0.52±0.21,TAM组0.32±0.11,乳岩宁组0.35±0.16,联合组0.19±0.09,各用药组与模型组比较,p38MAPK蛋白表达下降,存在显著性统计学差异（P<0.05）;联合组与TAM组及乳岩宁组相比,也存在显著性差异（P <0.05）,TAM组及乳岩宁组之间无统计学差异（P>0.05）。结论:1.乳岩宁能在体内增强TAM的抗裸鼠移植瘤作用,使肿瘤体积缩小。2.乳岩宁具有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用,与TAM合用则诱导凋亡作用更明显,可以增强TAM的细胞凋亡诱导作用,发挥抗肿瘤作用。3.TAM及乳岩宁均能下调MMP-2、MMP-9的表达,两药联合能起到协同效应。4.乳岩宁可能通过抑制p38MAPK信号通路的活性而降低c-fos蛋白的含量,从而抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表达,产生对乳腺癌的侵袭转移的抑制作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献综述
• 综述一:乳腺癌的中医药研究进展
• 综述二:p38MAPK 信号传导通路与乳腺癌的研究进展
• 第一部分 乳岩宁联合三苯氧胺对裸鼠乳腺癌细胞移植瘤的抑制及细胞凋亡的作用
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 分析讨论
• 结论
• 第二部分 乳岩宁联合三苯氧胺对裸鼠移植瘤MMP-2、MMP-9 表达的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 分析讨论
• 结论
• 第三部分 乳岩宁联合三苯氧胺对裸鼠移植瘤p38MAPK 通路的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 分析讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 个人简历