乙型肝炎病毒B，C基因型X蛋白在原核系统中的克隆表达与纯化

论文摘要

目的:应用分子克隆技术获得乙型肝炎病毒（HBV）B、C基因型X蛋白,为进一步研究X基因在乙型肝炎病毒所致疾病中的作用奠定基础。方法:①基因克隆:应用PCR技术,分别从本实验室构建的B、C基因型HBV保守的X基因真核表达重组子—pcDNA3.1-Xb和pcDNA3.1-Xc中获取X全长基因,产物经EcoR I和XhoI酶切,分别与原核表达载体pET-42a连接,转化BL-21感受态细胞,抗生素筛选阳性重组子,PCR、酶切、测序鉴定。②蛋白表达纯化:取鉴定后的B,C基因型X基因重组菌,IPTG诱导重组蛋白的表达,SDS-PAGE电泳,用GST抗体经Western Breeze化学发光法鉴定融合蛋白。优化诱导时间和IPTG浓度,诱导重组蛋白大量表达;低温诱导可溶性X蛋白的形成。分别用GST和Ni-NTA bind纯化试剂盒纯化X蛋白,比较两种方法的纯化效果,并用Bradford法测定重组蛋白浓度。结果:①PCR法获取的乙型肝炎病毒B、C基因型X基因的大小与预期一致;克隆后筛选的阳性重组子经PCR、酶切、测序鉴定正确。②重组子均可被IPTG诱导表达融合蛋白,表达产物可被GST抗体识别;当诱导时间为2 h、IPTG终浓度为0.5 mMol /L时,表达量均达最大,约为菌体总蛋白的40%以上;18℃,25℃,30℃均难以诱导可溶性蛋白的产生;溶解后的包涵体经复性后进行GST纯化,但是最终未能得到目的蛋白;而用Ni-NTA纯化后可直接得到大量融合蛋白,而且纯度可达95%以上。结论:成功构建了B、C基因型乙型肝炎病毒X基因的原核表达系统,并获得高效表达;重组蛋白经Ni-柱纯化后可得到大量重组蛋白,且纯度较高,为进一步研究X基因在乙型肝炎病毒所致疾病中的作用奠定基础。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、英汉缩略名词对照表
• 四、前言
• 五、正文
• 第一部分 乙型肝炎病毒B,C 基因型X 基因原核表达系统的构建
• 1. 引言
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第二部分 乙型肝炎病毒B,C 基因型X 基因的表达及纯化
• 1. 引言
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 六、参考文献
• 七、 综述
• 参考文献
• 八、致谢