论文摘要
目的:构建RNA干扰真核表达载体,观察其对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12细胞)中CaMKIIβ基因的抑制作用。方法:设计并合成针对CaMKIIβ基因的正义链和反义链,退火并克隆到RNAi质粒表达载体,脂质体法转染PC12细胞株后,不同时间点提取RNA及蛋白质,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测其对CaMKIIβmRNA及蛋白质水平的影响。结果:成功构建RNAi质粒表达载体,转染PC12细胞后可以抑制CaMKIIβmRNA及蛋白质的表达。与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对CaMKIIβmRNA的抑制率24h、48h、72h和96h分别约为17.95%,46.40%,64.69%和49.37%,蛋白抑制率72h约为74.77%,统计结果分析表明,两组差异有统计学意义。RNAi表达载体可以有效地抑制PC12细胞CaMKIIβ基因的表达。目的:研究CaMKII在RA激活ERK和p38过程中的作用,试图揭示RA通过MAPK途径引起PC12细胞凋亡的可能机制,为进一步探讨RA诱导神经细胞凋亡的机制以及凋亡与神经管畸形之间的联系提供理论依据。方法:RA刺激PC12细胞后,Western blot技术观察CaMKII, ERK1/2和p38磷酸化状态的变化。形态学观察,染色质浓缩及DNA Ladder检测细胞凋亡。同时应用RNA干扰真核表达载体抑制CaMKIIβ的基因表达后,检测RA激活的ERK1/2和p38变化。结果:1. RA可以增加CaMKII,ERK1/2和p38的磷酸化用10μM的RA刺激PC12细胞,分别设定不同的时间点,Western blot免疫印迹,结果显示磷酸化的CaMKII在RA作用后10min开始升高,20min达到高峰。不同的时间点检测显示RA也可以增加ERK和p38的磷酸化,其达到峰值的时间分别为1h, 30min。2. RA诱导ERK1/2和p38的磷酸化是通过CaMKII途径实现在我们的实验中,RA刺激后不同时间进行Western blot分析,ERK和p38达到峰值的时间均在在CaMKII之后,表明CaMKII是磷酸化的ERK1/2和p38的上游分子。所以预先用真核表达载体转染细胞作用72h,抑制CaMKII基因表达之后,再用RA刺激,Western blot检测磷酸化的ERK和p38的变化。结果发现使用siRNA显著减弱了RA引起的ERK和p38磷酸化,这些结果表明CaMKII可能在RA诱导ERK和p38活化中扮演重要角色。3. RA可以诱导PC12细胞发生凋亡用10μM的RA刺激PC12细胞,显微镜观察细胞的形态,发现细胞体积变小,出现皱缩现象。RA诱导的细胞用Hoechst33258染色,荧光显微镜观察可见大量核浓缩,染色质致密的凋亡细胞。细胞凋亡时的主要生物化学特征是其染色质DNA在核小体单位之间断裂,形成DNA片断。RA刺激PC12细胞后,提取DNA,琼脂糖凝胶电泳显示DNA ladder。结论:RA激活ERK1/2和p38是通过CaMKII实现的,CaMKII可能在RA诱导PC12细胞凋亡中的发挥重要作用。
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- [22].细胞凋亡在动脉粥样硬化发生发展中的作用[J]. 福建医药杂志 2008(03)
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