论文摘要
破骨细胞来源于骨髓单核-巨噬细胞系,多种细胞因子、激素和转录因子等通过调节成骨细胞分泌的破骨细胞分化因子（RANKL）、护骨素（OPG）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的水平间接调控破骨细胞的分化和骨吸收活性。此外,降钙素、雌激素和成纤维细胞生长因子（FGFs）等还直接作用于破骨细胞,通过调节相关信号通路分子的活性来直接调控破骨细胞的分化成熟和骨吸收活性。FGFs是体内重要的信号调节分子,已发现多种FGFs（FGF2、FGF9、FGF18和FGF23）可调控破骨细胞的分化和骨吸收功能。FGFs属于分泌型蛋白分子,生物学效应需通过细胞膜上的成纤维生长因子受体（FGFRs）来实现,提示FGFRs参与了破骨细胞功能的调节。FGFR1是破骨细胞表达的主要FGFRs,成熟破骨细胞受FGF2刺激后,出现FGFR1的磷酸化水平上调,提示FGFR1在破骨细胞功能的直接调控中发挥重要作用,但缺乏直接证据。同时,FGFR1在成骨细胞中亦大量表达,已发现在早期成骨细胞条件性敲除Fgfr1（用CollgenI-Cre）后会影响破骨细胞的分化和活性,提示FGFR1在破骨细胞功能的间接调控中也发挥重要作用,但其分子机制目前尚不清楚。此外,成骨细胞调控破骨细胞的能力受其分化程度影响,成年期间骨骼的成骨细胞以成熟的成骨细胞、特别是骨细胞为主,目前不清楚在成熟成骨细胞表达的FGFR1是否对破骨细胞的功能产生影响。本课题利用在破骨谱系细胞和成熟成骨细胞条件性敲除Fgfr1的小鼠模型并结合体内外实验,探讨FGFR1对破骨细胞的直接、间接调节作用及分子机制。主要内容包括两部分:1.通过体内、外实验探讨FGFR1对破骨细胞的直接调控作用及机制;2.通过体外实验探讨FGFR1对破骨细胞的间接调控作用及机制。主要实验内容及方法如下:第一部分FGFR1对破骨细胞的直接调控作用及机制研究动物分组:破骨谱系细胞条件性Fgfr1敲除小鼠（Lyzs-Cre;Fgfr1f/f）;对照小鼠（Fgfr1f/f）。1.体内实验:1)通过X-线摄像、藏红/固绿（SO/FG）染色,分别在整体水平和组织水平观察4月龄敲除小鼠和对照小鼠胫骨骨重建差异;通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测骨重建过程中破骨细胞功能的变化。2)利用4月龄敲除小鼠和对照小鼠建立胫骨不稳定骨折模型,通过骨痂组织X-线摄像、SO/FG染色,分别在整体水平和组织水平观察敲除小鼠和对照小鼠骨折愈合差异;通过TRAP染色观察骨折愈合过程中破骨细胞功能的变化。2.体外实验:1)分离6w龄敲除小鼠和对照小鼠的骨髓单核细胞,利用RANKL和M-CSF进行破骨细胞诱导分化和骨吸收实验。通过破骨细胞TRAP染色计数和骨吸收陷窝面积统计来观察破骨细胞的分化和骨吸收活性。2)提取诱导培养8d的破骨细胞总RNA和总蛋白,采用Real-Time PCR和Western blot技术,检测破骨细胞功能分子TRAP、Ctsk和MMP-9的表达水平及MAPK信号通路分子（p38、Erk和JNK）活化水平。第二部分FGFR1对破骨细胞的间接调控作用及机制研究动物分组:成熟成骨细胞条件性敲除小鼠（OC-Cre;Fgfr1f/f）;对照小鼠（Fgfr1f/f）。1.成骨细胞增生凋亡检测:利用新生敲除小鼠和对照小鼠的头盖骨分离成骨细胞,采用计数法绘制成骨细胞生长曲线,利用TUNEL法检测成骨细胞凋亡。2.成骨细胞中与破骨细胞功能相关分子检测:提取培养第3代成骨细胞总RNA和总蛋白,利用Real-Time PCR和Western blot检测成骨细胞中RANKL、OPG和M-CSF的表达及MAPK信号通路的活化水平。3.共培养实验:培养第3代敲除Fgfr1的成骨细胞和对照成骨细胞分别与野生小鼠骨髓单核细胞接种于同一培养皿中建立共培养模型。通过对共培养体系中破骨细胞TRAP染色计数和骨吸收陷窝面积统计来观察共培养体系中破骨细胞的分化和骨吸收活性。主要实验结果:一、FGFR1通过上调破骨细胞中Erk激酶的活性来促进破骨细胞的的分化及骨吸收活性1. 4月龄敲除小鼠和对照小鼠胫骨骨组织形态无明显差异,骨小梁破骨细胞数量及形态无明显变化。骨折修复观察则显示:骨折10d,敲除小鼠和对照小鼠骨折愈合未见明显差异。骨折愈合中后期（14d、21d和28d）,敲除小鼠的骨痂X线密度偏低,软骨痂降解速度慢,骨折线消失迟缓,破骨细胞数量与铺展面积亦明显低于对照小鼠（P<0.05）。提示,FGFR1不影响4月龄小鼠骨重建过程中破骨细胞的功能;但破骨谱系细胞条件性敲除Fgfr1小鼠的骨折愈合延迟,愈合中后期破骨细胞的分化和活性均受抑制。2.敲除小鼠骨髓单核细胞体外RANKL/M-CSF直接诱导形成的破骨细胞数量显著减少（P<0.05）,骨片上破骨细胞铺展不佳,吸收陷窝面积明显减小（P<0.05）。分子检测发现,敲除Fgfr1的破骨细胞中TRAP和MMP-9的表达显著下调（P<0.05）,MAPK信号通路成员Erk激酶的活化水平明显下降（P<0.05）。提示,FGFR1可能通过上调破骨细胞中Erk激酶的活性及破骨细胞功能分子TRAP和MMP-9的表达来促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。。二、FGFR1通过上调成骨细胞中M-CSF、下调OPG的表达来促进共培养体系中破骨细胞的分化和骨吸收功能敲除Fgfr1的成骨细胞增生和凋亡明显加快（P<0.05）,成骨细胞中Erk和p38激酶的活性及M-CSF的表达化显著下降（P<0.05）,OPG表达则明显上调（P<0.05）。在敲除Fgfr1的成骨细胞与野生小鼠骨髓单核细胞建立的共培养体系中,破骨细胞的数量及骨吸收陷窝面积均明显小于对照（P<0.05）。上述结果提示:FGFR1抑制成骨细胞的增生凋亡,上调成骨细胞中p38与Erk的活性及M-CSF的表达,抑制成骨细胞中OPG的表达,进而促进共培养体系中破骨细胞的分化与骨吸收活性。主要结论:1. 4月龄破骨谱系细胞条件性敲除Fgfr1小鼠骨重建过程中破骨细胞功能无明显变化;但FGFR1促进小鼠骨修复过程中破骨细胞的分化与骨吸收活性。2. FGFR1通过上调破骨细胞中Erk激酶的活性及破骨细胞功能分子TRAP和MMP-9的表达来促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。3. FGFR1抑制成骨细胞的增生凋亡,上调成骨细胞中p38与Erk激酶的活性及M-CSF的表达,抑制成骨细胞OPG的表达,进而促进共培养体系中破骨细胞的分化与骨吸收活性。