猪白细胞介素-10重组乳酸菌的制备与初步应用研究

论文摘要

畜牧业是现代农业产业体系的重要组成部分,同时也是我国农业和农村经济结构战略性调整中的优势产业。我国是生猪生产大国,同时也是猪肉消费大国。尽管集约化、高密度养殖模式解决了人口密度的增加对猪肉产品的消费问题,但由于高度集约化养殖条件下,猪免疫力和抗应激能力下降,排放病原微生物和接触病原微生物机会增加,导致患病率和死亡率增加,生长速度缓慢,养殖收入下降以及猪肉产品供应不足等。因此,提高猪的自身免疫水平、增加对病原微生物的抵御能力对于促进我国养猪业持续健康发展、促进农村经济增长水平和保障优质猪肉产品供应具有重要的现实意义。白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）是最初在小鼠Th2细胞分泌物中发现的一种独特的细胞因子,因其能抑制Thl细胞因子的合成而引起了国内外学者的广泛关注。研究发现IL-10由活化的免疫细胞产生,尤其是单核巨噬细胞和T细胞亚群包括Tr1、Treg以及Th1细胞。随后发现B细胞、树突状细胞、角质化细胞、肥大细胞等也都能产生IL-10[1]。IL-10能抑制Thl细胞产生和释放IL-2、IFN-y等促炎因子,具有很强的抗炎及免疫抑制活性,可减少MHCⅡ的表达。另外,IL-10可刺激B细胞分化为浆细胞产生抗体。作为体内少有的双向免疫调节因子,其独特的免疫调节作用已成为研究的热点。本研究将猪IL-10基因克隆至大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中,经电转化至乳酸菌中,得到具有免疫调节活性的重组乳酸菌,对研制开发具有免疫调节功能的重组乳酸菌制剂,用以保障动物安全生产和动物性食品安全生产具有一定的意义。具体研究内容及结果如下：从猪脾脏中提取总RNA,反转录成cDNA,根据GenBank所发表的猪白细胞介素10（pIL-10）基因序列,设计并合成引物,应用RT-PCR技术,体外扩增pIL-10。将pIL-10基因与pMD18-T载体连接转化至E.coli DH5α,构建克隆载体pMD18-T-pIL-10,提取质粒,通过PCR、限制性内切酶酶切、测序等方法鉴定,与Genbank上公布的pIL-10基因序列同源性达到100%。证明成功构建了pMD18-T-pIL-10克隆载体。用限制性内切酶双酶切PMD18-T-pIL-10中的pIL-10基因并克隆至大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP-409中,构建重组质粒pSIP-409-pIL-10。经电转化至Lb.plantarum NC8中,构建重组乳酸菌,经清酒乳杆菌素sakasin-P（SppIP）诱导后经SDS-PAGE电泳分析,该重组乳酸菌表达约18kDa蛋白质量,表达产物与预期大小相符。经Western blot分析表明IL-10具有反应原性。将重组乳酸菌给21日龄的断奶仔猪连续胃内接种三周,在第二周开始时,同时胃内接种ETEC O149:K88一周,直至仔猪发病。结果显示,与对照组相比,重组乳酸菌pSIP409-IL-10可增强仔猪的细胞免疫水平,刺激机体产生抗体并诱导局部黏膜反应,下调炎性因子TNF-a水平同时促进抗炎因子IL-4的表达,可明显改善仔猪组织病理变化,通过对IL-10及TNF-α抗原定位和肠道内容物检测,表明重组菌成功在肠道内定植。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 白细胞介素-10概述
• 1.2 乳酸菌概述
• 1.3 产肠毒素大肠杆菌概述
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 猪白细胞介素-10基因的克隆和序列分析
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 重组表达载体pSIP409-IL-10的构建及表达
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 猪白细胞介素-10重组乳酸菌的初步应用研究
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介