六种植物病毒Real Time PCR定量方法的建立及其应用

论文摘要

植物病毒的检测是植物病毒病监测防控中最为重要的环节之一。以往常规的血清学检测,核酸杂交检测和传统PCR技术在植物病毒检测应用方面都或多或少存在着不完善的地方。因此,本研究以荧光定量PCR技术为基础,锚定水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）、三种大麦黄矮病毒（Barely yellow dwarf viruses,BYDVs）、小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）和黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的CP序列基因保守区域,分别建立了各自的用于定量检测的Real Time PCR方法。同时,应用这些方法对这几种病毒进行了初步的定量检测研究。主要内容如下:1.建立了一套用于定量检测RSV的One Step Real Time RT-PCR方法。通过序列比对,在RSV CP序列保守区域内设计特异性的引物和探针;通过在GenBank中用BLAST进行比对,证实引物探针特异性很高。对RSV One Step Real Time RT-PCR反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为0.2μmol/L。建立标准曲线,检测灵敏度可达到20拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过与ELISA检测技术的灵敏度对比,该实时荧光定量PCR方法展现出极高的灵敏性。对感RSV水稻不同组织内和单头带毒灰飞虱体内RSV CP RNA进行绝对定量检测。结果显示,水稻叶片中病毒RNA含量高于茎组织;雌虫灰飞虱体内较雄虫携带有更多的病毒RNA,并且虫体的胸腹部是病毒RNA最主要的聚集区,而虫体头部病毒RNA含量极低。2.针对BYDV GPV、GAV和PAV的定量检测,分别建立了One Step Real Time RT-PCR方法。三套独立的检测体系检测靶基因序列均位于BYDV CP保守序列上。GPV检测探针标记FAM荧光基团,GAV检测探针标记CY5荧光基团,PAV检测探针标记HEX荧光基团。建立标准曲线,三套定量检测体系的检测灵敏度均可以达到50拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过对感病小麦的检测证明所建立的Real Time PCR体系是成功的。3.建立了一套用于定量检测WDV小麦株系的Real Time PCR方法。通过序列比对,分别在WDV小麦株系CP基因和长非编码区设计了两组引物探针。其中锚定长非编码区的引物和探针组合可以很好的区分WDV小麦株系和大麦株系。使用锚定CP基因的引物探针组合建立Real Time PCR定量检测方法。通过对反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为0.2μmol/L。建立标准曲线,检测灵敏度可达到30拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过与ELISA检测技术的灵敏度对比,该实时荧光定量PCR方法展现出比ELISA检测要高的多的灵敏性。通过对田间采集的26组疑似WDV侵染小麦样品进行定量检测,其中24组样品检测为阳性,病毒检出率为92.3%。而同时采用传统普通PCR进行检测,仅有12组样品检测为阳性,病毒检出率不到50%。由此可见,本研究中所建立的荧光定量检测方法相对于传统PCR检测具有更高的灵敏度。对采集自病区的单头条沙叶蝉体内WDV进行绝对定量,结果显示该定量方法适合于单头介体昆虫带毒量的检测;进而为小麦产区WDV介体昆虫带毒率分析提供了一种新颖的,灵敏的,准确的手段。使用第二组引物探针,针对本实验室采集的大麦样品进行WDV小麦株系的检测。结果显示,样品YNKM-29,YNKM-38,YNKM-39和YNKM-43可以检测到WDV小麦株系DNA。4.建立了一套用于定量检测CGMMV的One Step Real Time RT-PCR方法,并首次将检测靶基因锚定于病毒CP基因上。通过摸索改进,建立了一套比较适合提取富含多糖多酚植物样品总RNA的方法。对反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为0.2μmol/L。建立标准曲线,检测灵敏度可达到50拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。利用建立的定量方法对西瓜种子不同部位组织带毒量进行了检测。结果显示,子叶组织中病毒RNA含量极高,外种皮次之,内种皮最低。由此可见,子叶是西瓜种子内病毒RNA聚集最为主要的部位。

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摘要

Abstract

第一章文献综述

1.1 植物病毒的检测

1.1.1 生物学检测法

1.1.2 血清学检测法

1.1.3 电子显微镜检测法

1.1.4 分子生物学检测方法

1.2 实时荧光定量PCR研究进展

1.2.1 定量原理

1.2.2 探测化学物质

1.2.3 实时荧光定量PCR的特点

1.2.4 实时荧光定量PCR技术的应用

1.3 本研究中涉及的几种植物病毒

1.3.1 水稻条纹病毒

1.3.2 大麦黄矮病毒GAV、GPV和PAV

1.3.3 小麦矮缩病毒

1.3.4 黄瓜绿斑驳花叶病毒

1.4 本研究的目的和意义

第二章 RSV Real Time PCR定量检测方法的建立及其应用

2.1 材料

2.1.1 供试样品

2.1.2 质粒与细菌菌株

2.1.3 主要分子生物学试剂与耗材

2.1.4 主要分子生物学试剂及培养基的配制

2.1.5 引物和探针

2.1.6 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 RSV One Step Real Time RT-PCR标准曲线的制作

2.2.2 UBQ5 One Step Real Time RT-PCR标准曲线的制作

2.2.3 RSV One Step Real Time RT-PCR定量方法的应用

2.3 结果与分析

2.3.1 RSV CP的克隆和测序

2.3.2 RSV CP RNA的体外合成制备

2.3.3 RSV One Step Real Time RT-PCR反应条件的优化

2.3.4 RSV One Step Real Time RT-PCR标准曲线的制作

2.3.5 UBQ5 的克隆和测序

2.3.6 UBQ5 RNA的体外合成制备

2.3.7 UBQ5 One Step Real Time RT-PCR反应条件的优化

2.3.8 UBQ5 One Step Real Time RT-PCR标准曲线的制作

2.3.9 RSV One Step Real Time RT-PCR定量方法的应用

2.4 讨论

2.4.1 RSV One Step Real Time RT-PCR定量方法的建立

2.4.2 RSV One Step Real Time RT-PCR在RSV检测定量评估中的作用

第三章 BYDV Real Time PCR定量检测方法的建立

3.1 材料

3.1.1 供试样品

3.1.2 质粒载体

3.1.3 引物和探针

3.2 方法

3.2.1 BYDV-GAV、GPV和PAV CP基因的体外转录及RNA的纯化

3.2.2 BYDV-GAV、GPV和PAV One Step Real Time RT-PCR标准曲线制作

3.3 结果与分析

3.3.1 BYDV-GAV、GPV和PAV CP基因的体外转录及RNA的纯化

3.3.2 BYDV-GAV、GPV和PAV One Step Real Time RT-PCR标准曲线制作

3.4 讨论

3.4.1 BYDV-GAV、GPV和PAV One Step Real Time RT-PCR定量方法建立

第四章 WDV Real Time PCR定量方法的建立及应用

4.1 材料

4.1.1 供试样品

4.1.2 实验试剂

4.1.3 引物和探针

4.2 方法

4.2.1 WDV Real Time PCR标准曲线的制作

4.2.2 WDV Real Time PCR定量方法的应用

4.3 结果与分析

4.3.1 WDV片段的克隆和测序

4.3.2 WDV Real Time PCR标准曲线的制作

4.3.3 WDV Real Time PCR的应用

4.4 讨论

4.4.1 WDV Real Time PCR定量方法的建立

4.4.2 WDV Real Time PCR在WDV定量评估中的应用

第五章 CGMMV Real Time PCR定量检测方法的建立及应用

5.1 材料

5.1.1 供试样品

5.1.2 实验试剂

5.1.3 引物与探针

5.2 方法

5.2.1 CGMMV One Step Real Time RT-PCR标准曲线的制作

5.2.2 CGMMV One Step Real Time RT-PCR定量方法的应用

5.3 结果与分析

5.3.1 CGMMV CP的克隆和测序

5.3.2 CGMMV CP RNA的体外合成制备

5.3.3 CGMMV One Step Real Time RT-PCR标准曲线的制作

5.3.4 CGMMV One Step Real Time RT-PCR的应用

5.4 讨论

5.4.1 CGMMV One Step Real Time RT-PCR定量方法的建立

5.4.2 CGMMV One Step Real Time RT-PCR在CGMMV定量评估中的应用

第六章论文总体结论、创新点及需进一步研究的问题

6.1 结论

6.2 创新点

6.3 有待进一步研究和完善的问题

参考文献

致谢

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