论文摘要
拓扑异构酶I （Top Ⅰ）是一种在生物体内参与细胞内DNA复制、转录、修复和重组等关键过程的酶类之一,其主要通过DNA链剪切与再连接循环机制解决DNA扭转张力问题。自1988年证实真核生物Top I是喜树碱及其衍生物的唯一作用靶标以来,大量研究也揭示喜树碱及其衍生物主要通过稳定结合于DNA复制与转录过程中暂时形成的Top I-DNA可裂解复合物（Top Icc）来实现对细胞生长的抑制作用。本研究在开展前发现0.1-30μM喜树碱处理后的甜菜夜蛾中肠脂肪体细胞（IOZCAS-Spex-II）生长停止,并伴随细胞凋亡特征出现,同时还发现可能由Top Icc引发的DNA链断裂现象。鉴于喜树碱对昆虫和癌细胞的毒理特征类似,本文探讨了喜树碱发展成为植物源农药先导化合物的可能性,首先测定了喜树碱和羟基喜树碱对细胞粗酶液中甜菜夜蛾Top I酶解螺旋活性的影响,然后进行甜菜夜蛾Top I基因克隆与Top I蛋白质原核表达纯化,继而测定了喜树碱和羟基喜树碱对纯化Top I酶解螺旋活性的影响,并通过荧光定量PCR测定了喜树碱和羟基喜树碱对细胞内Top I基因表达水平的影响,最后测定了喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞内甜菜夜蛾Top I酶活性的动态变化,旨在从基因水平、转录水平和酶活性水平上阐明喜树碱对甜菜夜蛾Top I靶标的作用方式和机制,从而揭示喜树碱对昆虫生长抑制和致死作用的分子毒理机制,主要结论如下：通过联合反转录PCR （RT-PCR）和cDNA末端快速扩增法（RACE）分别扩增甜菜夜蛾Top I基因核心序列（1626bp）及其两末端序列。Top I cDNA全长序列为3743bp,其中5’UTR（非编码区）和3’UTR（非编码区）分别80bp和870bp,编码区中开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）长度为2793bp,编码930个氨基酸,以UAA为终止密码子。Clustalx软件多重比对结果表明,甜菜夜蛾Top I氨基酸序列与11个物种同源性均超过42.58%,并与家蚕Top I氨基酸序列同源性达到65.25%。以MEGA5.0构建的进化树显示,甜菜夜蛾Top I与喜树TopI间遗传进化距离较远,从而揭示出氨基酸多态性的存在与喜树碱敏感性或抗性发生相关。相比喜树Top Ⅰ,甜菜夜蛾Top Ⅰ蛋白质中喜树碱结合位点如E418,Q421,L617,R621,A653,E710,N722,S729（根据人Top I氨基酸序列编号）没有发生突变,从分子进化水平上表明甜菜夜蛾Top I是天然的喜树碱敏感蛋白质。为证实甜菜夜蛾Top Ⅰ是否具有喜树碱敏感特性,本研究建立Top I酶反应外体系,通过超螺旋DNA解旋法测定喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-II细胞粗酶液Top I和纯酶TOP70酶解螺旋活性的抑制影响。TOP70是去除N端335个氨基酸的非完整性Top I蛋白质,通过构建PGEX-TOP70重组载体,并在大肠杆菌BL21（DE）菌株中诱导表达纯化而得。抑制结果表明,喜树碱及羟基喜树碱对Top I酶解螺旋活性和纯酶TOP70的抑制影响具有浓度依赖性,呈类“S”型动力学曲线变化。当药物浓度在1.00-7.50μM间,喜树碱抑制率显著高于羟基喜树碱抑制率,而在浓度分别为0.01-1.00μM和7.50-100μM时,两药物抑制率无显著差异性。喜树碱及羟基喜树碱对TOP70的抑制率高于药物对细胞粗酶液TopI的抑制率,这表明蛋白纯化可消除未知蛋白对药物抑制率的影响,但不同状态下的酶本质上是不变的,只有量上的差异。细胞内甜菜夜蛾Top Ⅰ蛋白质对喜树碱具有敏感性,同时这种敏感性具有瞬时性和累积性,而不具有浓度依赖性。本研究采用酶液2倍稀释法测定每个药物处理下细胞内Top I酶活性,并作比较分析。结果表明,不同时间点上（0,2,4,6,12,24,48h）对照组细胞内Top Ⅰ酶比活力值间无显著差异（相对比活力值为1）。10.0μM喜树碱和10.0μM羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-II细胞表现出较为一致的时间积累性,随着处理时间的积累,Top Ⅰ酶活性逐渐降低到一个水平。两药物在24h对细胞内Top Ⅰ酶活性抑制率无显著差异,但在48h喜树碱对细胞内Top Ⅰ酶活性的抑制率显著高于羟基喜树碱,可检测到该时间点的细胞内Top I不能解旋DNA。同时,喜树碱和羟基喜树碱对细胞内Top I酶活性的影响没有显著的浓度相关性。除了0.50μM羟基喜树碱没有抑制细胞内Top I酶活性外,其余浓度梯度下的喜树碱和羟基喜树碱都能显著降低细胞内Top I酶活性（0.10,0.50,1.00,5.00,10.0,50.0,100μM）,浓度间Top I酶比活力值无显著差异性。细胞内甜菜夜蛾Top I mRNA表达量对喜树碱敏感性降低,而这种敏感性具有时间累积性,不呈浓度依赖性。通过荧光定量PCR测定每个药物处理组和对照组中Top I mRNA表达量,并用2-△△Ct方法进行浓度间和不同时间点间的比较分析。结果表明,在不同时间点上（0,2,4,6,12,24,48h）对照组细胞内TopI mRNA表达量间无显著差异（相对基因表达为1）。在12,24和48h,检测到10.0μM喜树碱和10.0μM羟基喜树碱处理后的IOZCAS-Spex-II细胞内Top ImRNA表达量都上调增加。但在48h,喜树碱处理细胞内Top I mRNA表达量仍然高于羟基喜树碱处理细胞内Top I mRNA表达量。除了50.0和100μM羟基喜树碱外,其余各浓度下喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞内Top I mRNA表达量都能上调增加（0.10,0.50,1.00,5.00,10.0,50.0,100μM）,浓度间Top I mRNA表达量无显著差异性。综上所述,喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-II细胞内Top I的作用是多水平交叉的,从而实现对细胞生长的抑制并诱导细胞死亡。基于Top I基因序列与细胞药物反应的分析,证实喜树碱对甜菜夜蛾Top I的多水平影响建立在转录水平上而不是在复制水平上。