未糖基化的酪蛋白巨肽在基因重组大肠杆菌中的表达

论文摘要

酪蛋白巨肽是人乳中K-酪蛋白C端的一个多肽片段,由64个氨基酸组成。它富含人体必需的基本氨基酸和支链氨基酸,因此它可以用作保健品和为特殊病人提供营养。本实验将利用聚合酶链式反应（PCR）克隆人源酪蛋白巨肽基因,并在大肠杆菌中进行原核表达。选用大肠杆菌的偏爱密码子化学合成法合成编码酪蛋白巨肽（hCMP）片段的DNA,在其基因的5’端和3’端引入Bam H I和Sac I位点。将PCR产物连接到表达载体pET-28a（+）七,构建重组表达载体pET-28a（+）-hCMP.将重组载体pET-28a（+）-hCMP转化E.coli DH5a。基因测序证明基因序列与理论相符。pET-28a（+）-hCMP转化E. coli BL21（DE3）,分别研究不同诱导温度、不同诱导时间、不同IPTG浓度、不同kan浓度和不同乳糖浓度对融合蛋白表达的影响,单因素实验结果表明,诱导前温度30℃,诱导后温度37℃时蛋白表达量最高。随时间的增加蛋白表达逐渐增加,4h融合蛋白表达量最高可占细菌总蛋白的57.51%。IPTG在较低浓度时有利于融合蛋白hCMP在表达菌中的表达,当IPTG浓度为0.2mM/L融合蛋白量最高。Kan浓度的变化对融合蛋白表达量无显著影响。乳糖可使E.coli BL21（DE3）的生长速度加快,浓度大于1%时融合蛋白表达量下降。然后采用正交试验对E.coli BL21（DE3）的培养条件进行研究,得出了优化后的发酵条件：诱导时间37℃,IPTG浓度为0.2mM/L,诱导时间8h,Kan浓度100mg/L。在此条件下,融合蛋白表达量可占细菌总蛋白的62.8%。E. coli BL21（DE3）表达菌渗透休克、超声波裂解后电泳,结果表明,融合蛋白大部分存在于细胞质和细胞周质中,包涵体中无融合蛋白存在。采用Ni-Sepharose亲和层析柱分离纯化hCMP,当咪唑浓度为300mM/L时,可达到较好的分离效果。重组蛋白经肠激酶酶切后,先经Ni-Sepharose亲和层析除去残留肽,然后经Sephadex G-10凝胶层析柱纯化,得到纯度达97%的hCMP,产量达25mg/L。Western-Blot鉴定证明大肠杆菌表达的融合蛋白符合预期结果,为人源酪蛋白巨肽。MALDI-TOF-MS进一步鉴定重组蛋白,并得到蛋白N端序列为IAIPPKK。本实验构建了人源酪蛋白巨肽重组表达质粒pET-28a（+）-hCMP,表达出6.7KD未糖基化的hCMP,经鉴定符合预期结果。从而,为大批量制备未糖基化hCMP提供了一个新方法。

论文目录

• 学位论文数据集
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 酪蛋白巨肽的研究现状及生物学作用
• 1.1.1 酪蛋白巨肽CMP
• 1.1.2 CMP的组成和结构
• 1.1.3 CMP的生物学活性和营养特性
• 1.2 CMP的生产方法
• 1.2.1 天然提取法
• 1.2.2 基因工程方法
• 1.3 CMP前景展望
• 1.4 大肠杆菌表达系统简介
• 1.4.1 用大肠杆菌进行基因表达的一般策略
• 1.4.2 影响基因重组蛋白质在大肠杆菌中表达的因素
• 1.4.3 表达类型的选择和培养条件的控制
• 1.4.4 外源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
• 1.5 重组蛋白的分离纯化
• 1.5.1 层析技术
• 第二章 酪蛋白巨肽的基因克隆
• 2.1 引言
• 2.2 试验材料与仪器
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 实验仪器和试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 引物设计及合成
• 2.3.2 引物磷酸化
• 2.3.3 Klenow补齐
• 2.3.4 PCR扩增
• 2.3.5 PCR产物回收（玻璃奶法）
• 2.3.6 连接
• 2.3.7 感受态细胞的制备
• 2.3.8 转化
• 2.3.9 挑菌
• 2.3.10 提质粒（碱裂解法）
• 2.3.11 酶切鉴定
• 2.3.12 目的基因的序列测定
• 2.3.13 目的基因连入表达载体pET-28a（+）
• 2.3.14 目的基因的序列测定
• 2.3.15 转化入E.coli BL21（DE3）
• 2.3.16 保存甘油管
• 2.4 结果分析讨论
• 2.4.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.2 酶切鉴定
• 2.4.3 测序鉴定
• 2.4.4 转化入E.coli BL21（DE3）
• 2.5 本章小结
• 第三章 基因工程菌培养条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 试验材料与仪器
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 培养方法
• 3.3.2 不同菌种选择
• 3.3.3 不同诱导温度对融合蛋白表达量的影响
• 3.3.4 不同诱导时间对融合蛋白表达量的影响
• 3.3.5 不同诱导剂浓度对融合蛋白表达量的影响
• 3.3.6 不同卡那霉素浓度对融合蛋白表达量的影响
• 3.3.7 不同乳糖浓度对融合蛋白表达量的影响
• 3.3.8 正交实验分析不同诱导条件对融合蛋白表达量的影响
• 3.3.9 正交优化结果对比验证
• 3.4 结果及讨论
• 3.4.1 不同菌种融合蛋白表达量分析
• 3.4.2 不同诱导温度对融合蛋白表达量的影响
• 3.4.3 不同诱导时间对融合蛋白表达量的影响
• 3.4.4 不同IPTG浓度对融合蛋白表达量的影响
• 3.4.5 Kan浓度对融合蛋白表达量的影响
• 3.4.6 乳糖浓度对融合蛋白表达量的影响
• 3.4.7 正交实验分析
• 3.4.8 正交优化结果对照
• 3.5 小结
• 3.5.1 宿主及载体
• 3.5.2 培养条件分析
• 第四章 CMP分离纯化与鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 融合蛋白在细菌E.coli BL21内的分布
• 4.3.2 融合蛋白分离纯化
• 4.3.3 Western-Blot鉴定融合蛋白
• 4.3.4 MALDI-TOF-MS鉴定hCMP
• 4.4 结果及分析
• 4.4.1 融合蛋白在菌体中的分布
• 4.4.2 融合蛋白分离纯化
• 4.4.3 Western-Blot鉴定融合蛋白
• 4.4.4 MALDI-TOF-MS鉴定hCMP
• 4.5 小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 附录
• 附录一 各种试剂的配制
• 附录二 培养基
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 作者和导师简介
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书