新型压电免疫传感技术用于白血病等重大疾患诊断的研究

论文题目: 新型压电免疫传感技术用于白血病等重大疾患诊断的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 分析化学

作者: 王桦

导师: 沈国励,俞汝勤

关键词: 临床疾病诊断,压电免疫传感技术,免疫材料固定化,等离子体聚合膜,纳米颗粒,聚电解质,急性白血病,寄生虫病

文献来源: 湖南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 急性白血病的免疫分型即利用特定单克隆抗体识别白血病细胞分化抗原的一种临床诊断手段，对于急性白血病的准确诊断、治疗方案的选择、预后的判断以及病因的探索等具有十分重要的意义。然而，目前临床上采用的主要急性白血病免疫分型方法普遍表型速度慢、定量能力低、操作复杂、仪器昂贵且需要专业技能，尚只能在少数实验室应用。从而开发一些简便、廉价、定量准确且易于临床推广的免疫传感分型技术是一件很有价值的工作。此外，近年来，一些人畜共患的传染性疾病肆虐人类，特别是一些原已得到控制的寄生虫病又有死灰复燃的趋势，其中以血吸虫病和弓形虫病最为典型，传播广泛且危害严重，成为世界上亟待解决的一个严重公共卫生问题。然而，当今寄生虫病的临床诊断检测方法，要么分析灵敏度低，要么操作繁琐费时，远不能满足目前寄生虫病防治工作的需要。因此，建立准确、快速、方便携带于现场疾病筛查和突发性疫情监控的寄生虫病诊断技术成为当务之急。利用化学与生物传感技术检测疾病标志物进行临床疾病的准确、快速诊断以及流行病的现场筛查与群体监控，是当前医学上既新颖又极具吸引力的热门研究课题之一。压电声波免疫传感技术是结合了压电效应的高灵敏性和免疫反应的高特异性的一种生物传感技术，可响应晶体表面质量负载以及体系(溶液)的密度、粘度、电导率、介电常数等多种信号变化。以简便、快速、灵敏、响应谱广、成本低、毋需示踪物标记、免样品纯化、可进行自动化实时数据输出等优点，突破了以往分析方法的诸多“瓶颈”，在临床疾病诊断的生化检测方面显示出诱人的应用前景。本论文以急性白血病、寄生虫病(血吸虫病和弓形虫病)、Wilson病、恶性贫血症、严重肝病等重大疾患标志物为检测对象或模式体系，一方面采用等离子体聚合膜(PPF)沉积技术、纳米颗粒倍增的生物修饰技术以及聚电解质自组装吸附技术等，开发了一系列普适的免疫材料的固定化新程序，并构建成压电免疫传感探针或阵列用于疾病的诊断检测；另一方面，以功能化纳米(或亚微米级)颗粒替代传统胶乳修饰免疫识别分子，利用纳米颗粒免疫凝集反应和压电非质量效应原理，凝集检测了多种疾病标志物。此外，以亚微米级核-壳结构磁性颗粒为载体修饰单抗，并借外加磁场的分离富集作用，实现了对目标物自动化、高灵敏的传感测定。具体内容包括： (1)首次研制了一种压电免疫传感阵列用于急性白血病的快速免疫分型(第2章)。采用氨基PPF膜和纳米金修饰压电晶体，用以分别固定白血病各亚型细胞特异的单抗片段，构建成探针阵列检测急性白血病细胞分化抗原。该阵列只需对样品作一次表型分析，即能鉴别出白血病细胞与正常白细胞，并确定白血病细胞新型压电免疫传感技术用于白血病等重大疾患诊断的研究的亚型(系);其定量检测白细胞的浓度范围为1少一1护。ells mL一’;将之用于临床样品分析，得到的表型结果与临床经典免疫分型法的结果基本一致。(2)开发了一种基于磁场免疫富集原理的急性白血病免疫传感分型技术(第3章)。以5102包覆ZnFeZO;颗粒制得亚微米级核一壳型磁性颗粒，经表面功能化后分别交联白血病各亚型细胞特异的单抗，借助磁化单抗的免疫识别和外加磁场的分离与富集作用，以流动注射方式检获急性白血病细胞分化抗原。该传感表型系统能自动化、高灵敏地区分急性淋巴系和髓系白血病细胞，并确定其相应的白血病亚型(系)，可定量测定浓度数量级低至一1护cens mL一’的白细胞。(3)提出了一种高特异检测弓形虫IgG抗体的压电免疫传感技术(第4章)。以油包水微乳法制得纳米5102颗粒并进行化学活化，用以键合锚固弓形虫抗原(TgAg)于氨基PPF膜修饰的传感器表面。通过采用正常兔血清(NRS)和牛血清白蛋白(BSA)封闭其表面非特异性吸附位点，并借琉基乙醇灭活样中抗体IgM成分，实现了对浓度稀释比范围1:5000~1:70弓形虫lgG抗体的特异检测。(4)发展了一种纳米金免疫凝集型压电传感技术用于弓形虫全抗体的快速检测(第5章)。以纳米金替代传统胶乳标记TgAg，并采用“抗凝剂”肝素修饰压电探针，用以直接响应TgAg一Nanogold颗粒免疫凝集事件引起的溶液参数的变化。该传感技术毋需固定活性组分和纯化样品，可快速检测浓度稀释比下限为一1:5500的兔血中弓形虫全抗体，定量能力与经典ELISA法相接近。(5)提出了一种可逆的日本血吸虫病压电免疫传感诊断技术(第6章)。以氨基PPF膜覆盖压电晶体，并将此与组装相反电荷的聚电解质Pss结合起来，构建成易于清除的界面以吸附固定血吸虫抗原(SjAg)，再借BSA和NRS试剂抑制背景非特性吸附的干扰，实现了对浓度范围0.54一犯.50林gmL一’血吸虫抗体的定量测定。(6)报道了一种简便的510:颗粒免疫凝集分析技术用于日本血吸虫病的快速筛查(第7章)。以亚微米级510:颗粒为载体标记SjAg，并以BSA封闭的压电晶体为检测探针，利用免疫凝集原理和压电非质量效应，直接响应SjAg一510:颗粒与相应抗体的免疫凝集反应。结果表明，该技术可定量、快速地确定血清样品的血吸虫感染程度，适用于血吸虫病临床诊断、现场筛查和疫情监控等。(7)提出了一种高灵敏的铜蓝蛋白压电免疫?

论文目录:

摘要

Abstract

第1章绪论

1．1 压电效应与压电传感理论基础

1．1．1 压电效应

1．1．2 压电气相传感理论

1．1．3 压电液相传感理论

1．2 压电免疫传感技术中免疫材料的固定化方法

1．2．1 免疫材料的一般固定化方法

1．2．2 免疫材料固定化技术的新进展

1．3 压电免疫传感技术及其研究进展

1．3．1 压电气相免疫传感技术

1．3．2 压电液相免疫传感技术

1．4 本研究论文的构想

1．4．1 急性白血病免疫传感分型诊断技术的研究

1．4．2 弓形虫病免疫传感诊断技术的研究

1．4．3 日本血吸虫病免疫传感诊断技术的研究

1．4．4 其它疾病标志物的检测及免疫材料固定化新技术的研究

第2章压电免疫传感阵列用于急性白血病的免疫分型

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 抗体片段的制备

2．2．3 压电传感探针的修饰

2．2．4 免疫传感分型方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 压电免疫传感阵列的构建

2．3．2 不同固定化界面的传感响应性能

2．3．3 样品稀释比的优化

2．3．4 免疫传感分型响应特征

2．3．5 定量分析

2．3．6 传感探针的再生

2．3．7 临床样品的免疫表型

2．4 小结

第3章基于磁场免疫富集的急性白血病免疫传感分型技术的研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器与试剂

3．2．2 核一壳型磁性颗粒的合成及其表面功能

3．2．3 磁化单抗的制备

3．2．4 检测系统的安装

3．2．5 免疫磁导传感表型

3．3 结果与讨论

3．3．1 功能化磁性颗粒的制备与表征

3．3．2 磁场导引的免疫富集检测

3．3．3 磁化单抗的用量

3．3．4 免疫传感分型的频率响应特征

3．3．5 免疫定量富集分析

3．3．6 初步应用

3．4 小结

第4章纳米SiO_2颗粒增强的免疫传感技术用于弓形虫IgG抗体的检测

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 仪器与试剂

4．2．2 纳米SiO_2的制备与活化

4．2．3 抗原的固定化

4．2．4 压电免疫测定

4．2．5 免疫荧光分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 功能化纳米SiO_2颗粒的制备

4．3．2 TgAg的固定

4．3．3 不同固定化方法的性能比较

4．3．4 Tg-IgM的灭活

4．3．5 质控试验

4．3．6 Tg-IgG的定量测定

4．3．7 压电传感探针的再生

4．3．8 实际样品的检验

4．4 小结

第5章基于纳米金免疫凝集的压电传感技术用于弓形虫全抗体的检测

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 仪器与试剂

5．2．2 TgAg-Nanogold颗粒的制备

5．2．3 压电传感探针的表面修饰

5．2．4 透射电镜(TEM)实验

5．2．5 免疫检测方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 TgAg-Nanogold颗粒的免疫凝集

5．3．2 压电传感探针的表面修饰

5．3．3 凝集反应条件的优化

5．3．4 非特异性凝集试验

5．3．5 免疫凝集反应的频率响应特征

5．3．6 免疫凝集检测的校准曲线

5．4 小结

第6章基于聚电解质吸附的日本血吸虫病免疫传感诊断技术的研究

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 仪器与试剂

6．2．2 抗原的固定化

6．2．3 检测方法

6．2．4 传感器的再生

6．3 结果与讨论

6．3．1 聚电解质静电吸附固定化方法

6．3．2 不同固定化方法的性能比较

6．3．3 抗原分子的包被

6．3．4 免疫反应的酸度条件及其频率响应特征

6．3．5 免疫应答中非特异性吸附的消除

6．3．6 不同固定化条件的传感特性比较

6．3．7 传感器的再生

6．3．8 实际样本分析

6．4 小结

第7章基于SiO_2颗粒免疫凝集的压电传感技术用于日本血吸虫病的筛查

7．1 引言

7．2 实验部分

7．2．1 仪器与试剂

7．2．2 SiO_2颗粒的制备与标记

7．2．3 透射电镜(TEM)实验

7．2．4 压电传感探针的制备

7．2．5 免疫凝集检测

7．3 结果与讨论

7．3．1 SjAg-SiO_2颗粒的免疫凝集

7．3．2 免疫凝集反应的条件

7．3．3 PEG的应用

7．3．4 特异性与非特异性凝集响应特征

7．3．5 免疫凝集检测特性

7．3．6 实际样品分析

7．4 小结

第8章高灵敏的铜蓝蛋白压电免疫传感技术的研究

8．1 引言

8．2 实验部分

8．2．1 仪器与试剂

8．2．2 正丁胺 PPF膜的制备

8．2．3 AFM成像

8．2．4 抗体的固定化

8．2．5 免疫检测方法

8．3 结果与讨论

8．3．1 正丁胺PPF膜的表征

8．3．2 固定化界面的构建

8．3．3 抗体的固定化条件

8．3．4 PEG对响应信号的放大

8．3．5 Cp的定量检测

8．3．6 传感器的再生

8．3．7 临床样品分析

8．4 小结

第9章可更新的转铁蛋白压电免疫传感技术的研究

9．1 引言

9．2 实验部分

9．2．1 仪器与试剂

9．2．2 抗体的固定化

9．2．3 检测方法

9．3 结果与讨论

9．3．1 正丁胺PPF膜的形成

9．3．2 聚电解质层的自组装

9．3．3 抗体分子的包被

9．3．4 免疫反应的主要条件及其频率响应特征

9．3．5 传感器的主要检测特性

9．3．6 传感器的再生

9．3．7 临床样品分析

9．4 小结

第10章纳米金界面吸附的生物分子固定化技术的研究

10．1 引言

10．2 实验部分

10．2．1 仪器与试剂

10．2．2 抗体的固定化

10．2．3 检测方法

10．2．4 AFM成像

10．3 动力学参数的测算

10．4 结果与讨论

10．4．1 纳米金颗粒在氨基 PPF膜上的自组装

10．4．2 抗体活性的考察

10．4．3 IgM的免疫检测

10．4．4 传感器的再生

10．4．5 样品分析

10．5 小结

第11章纳米金-蛋白A介导的抗体定向固定化新程序

11．1 引言

11．2 实验部分

11．2．1 仪器与试剂

11．2．2 抗体的固定化

11．2．3 检测方法

11．3 结果与讨论

11．3．1 PPF-Nanogold-PA固定化程序

11．3．2 实验条件的优化

11．3．3 抗体的固定化特性

11．3．4 免疫反应的频率响应特征

11．3．5 传感器的分析性能

11．3．6 传感器的再生特性

11．4 小结

第12章纳米颗粒倍增的抗体片段吸附免疫平台的构建

12．1 引言

12．2 实验部分

12．2．1 仪器与试剂

12．2．2 抗体片段的制备

12．2．3 抗体片段的固定化

12．2．4 检测方法

12．2．5 热动力学分析

12．3 结果与讨论

12．3．1 抗体片段的制备与固定化

12．3．2 抗体的固定化特性

12．3．3 免疫反应的热动力学特性

12．3．4 传感器的检测特性

12．4 小结

结论

参考文献

致谢

附录A(攻读学位期间发表的学术论文目录)

发布时间: 2005-04-04

参考文献

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新型压电免疫传感技术用于白血病等重大疾患诊断的研究

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