与HSV-1 UL31相互作用的宿主蛋白TMEM140生物学功能研究

论文摘要

单纯疱疹病毒Ⅰ型是一种结构复杂,感染形式多样,病理效应复杂的一种双链DNA病毒,与RNA病毒的感染在胞质中完成病毒颗粒的装配形式不同,疱疹病毒的DNA复制、衣壳体的形成、病毒颗粒的组装均是在核内进行。衣壳体将基因组包裹后,穿过核内膜,以出芽的方式进入核周隙,衣壳体在穿过核内膜的同时完成初膜化。病毒蛋白u131和u134以复合体的形式促进了这一过程[13]。鉴于病毒与宿主间相互竞争的关系。在病毒感染过程中,宿主必然采取某种防御机制来进行自我保护。为了了解病毒组装及出核期间与细胞分子作用的相关机制,本实验将UL31基因作为诱饵基因,利用酵母双杂交体系和人肝组织cDNA预制文库,初步筛选出与UL31相互作用的候选蛋白,通过自激活、β-gal、免疫共沉淀等实验的进一步筛选,我们最后确定TMEM140作为主要研究对象,探究其在病毒装配释放中的功能作用。本课题以分子生物学、病毒学、细胞生物学和免疫学等实验为基础对TMEM140的功能特性进行了研究。首先,通过荧光定位实验观测TMEM140-GFP在细胞中的定位,结果可见正常状态下TMEM140-GFP融合蛋白定位于胞浆中,但当感染了HSV1后,部分TMEM140-GFP蛋白向胞核转移。接着,通过噬斑形成实验（PFU）观察到当TMEM140高表达时可以抑制HSV1病毒的增殖活性。而当我们干扰TMEM140在细胞中的表达时,抑制作用得以逆转。随后,通过透射电镜分别观察病毒在高表达TMEM140的细胞以及正常细胞中的分布情况,发现正常细胞病变程度较大,病毒颗粒大部分释放到胞外,而高表达了TMEM140的实验组中病毒以组装好的衣壳形态大量存在于核内。之后,实验构建了连入UL31CR1区片段的标签载体,通过免疫共沉淀实验证明了TMEM140是与UL31CR1区结合,而这一区域正好是UL34与UL31结合形成UL31/UL34复合体的关键区域。接着,通过生物信息学的方法对六种疱疹病毒UL31 CR1区同源蛋白氨基酸序列进行比对,确定了6个保守位点,分别将这6个保守位点进行定点突变,用免疫共沉淀的方法验证突变点对TMEM140与UL31的结合是否有影响,结果显示,HSV1第94位氨基酸的改变对TMEM140与UL31的结合存在直接的影响。通过对TMEM140蛋白功能的初步分析,基于以上实验结果,初步推测：TMEM140很有可能是作为UL34的竞争者与UL31结合,从而阻断了UL31/UL34复合体的形成,进而削弱了UL31/UL34帮助病毒颗粒出核形成成熟病毒释放的作用,最终对病毒的装配释放起到抑制作用。以上结果提示,在病毒初膜化的过程中,一方面病毒利用自身编码蛋白促进自体成熟与释放,而另一方面宿主为了抵御病毒的侵害,阻断或妨碍病毒蛋白行使其功能,对这一博弈过程的具体机理和与其相关的宿主蛋白分子、病毒编码蛋白以及它们相互作用的途径和理论的研究,将有助于我们对疱疹病毒感染生物学过程的分子生物学细节的深入了解,亦能够为这类病毒性疾病的预防和治疗提供理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 一、实验材料方法
• （一）、实验材料
• （二）、实验方法
• 二、结果及分析
• （一）、重组质粒的构建
• （二）、UL31在原核细胞中的表达、纯化及小鼠抗血清的制备
• （三）、UL31抗血清的特异性检测
• （四）、UL31的细胞定位分析
• （五）、UL31高表达对HSVI病毒的促进作用
• （六）、UL31酵母双杂交筛选与UL31相互作用的细胞内蛋白
• （七）、免疫共沉淀实验验证UL31与TMEM140在体内的相互作用
• （八）、TMEM140在细胞内的定位分析
• （九）、上调TMEM140的表达对HSV1病毒滴度有的抑制作用
• （十）、下调TMEM140的表达能逆转其对HSVI的抑制作用
• （十一）、透射电镜观察TMEM140对HSVI病毒分布的影响
• （十二）、TMEM140不同截短片段与UL31 CR1区的相互作用
• （十三）、UL31 CR1区保守位点的突变对TMEM140结合的影响
• 三、讨论
• （一） UL31编码蛋白及其功能
• （二） TMEM140的发现
• （三） TMEM140对病毒的抑制作用
• （四） TMEM140作用机制
• （五） 需要进一步思考的问题
• 四、小结
• 参考文献
• 论文综述一
• 参考文献
• 论文综述二
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究生简历