论文摘要
肝纤维化是肝脏弥漫性病变发展为肝硬化的中间过程和重要阶段,是细胞外基质合成和降解不平衡的结果,HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN是细胞外基质的重要组成成分,检测其血清学水平对肝纤维化诊断有参考价值。应用影像学方法无创性评价肝纤维化一直是研究的热点,但肝纤维化各期、乃至早期肝硬化缺乏特异性影像学表现。许多学者应用Doppler超声测量肝动脉、门静脉、肝静脉血流量或血流速度、阻力指数等评价肝纤维化或肝硬化,结果存在一定争议。有学者利用微泡声学造影剂能够增强Doppler信号的特点,建立了诊断肝硬化的新方法,但对于肝纤维化阶段的评价作用尚有争议,另外应用Doppler的方法存在易出现伪像且后处理过程复杂等缺点。本研究通过对肝纤维化动物模型及肝纤维化患者应用第二代声学造影剂Sono Vue在脉冲反相谐波模式下进行肝脏超声造影,观察造影剂到达肝动脉、门静脉、肝静脉时间及肝实质时间-强度曲线变化,探讨超声造影（contrast enhanced ultrasound,CEUS）能否反映肝纤维化进展过程中微循环的变化,并评价血清学、Doppler超声、CEUS对肝纤维化的诊断效能。材料与方法1、动物实验部分健康雄性Wistar大鼠70只,随机选取其中的62只大鼠进行肝纤维化模型制作,造模方法:首次按4ml/kg剂量经皮下注射60%CCl4,以后每周两次按2ml/kg剂量经皮下注射60%CCl4;另8只大鼠为对照组,每周两次按2ml/kg经皮下注射生理盐水,首次剂量为4ml/kg。分别于5周、7周、9周、11周随机从进行造模的大鼠中取10只,从对照组大鼠中取2只进行超声造影检查。首先对大鼠肝脏进行二维超声检查,在同时显示门静脉与肝静脉的切面切换至CEUS程序。按0.1ml/Kg剂量经尾静脉团注微泡声学造影剂Sono Vue,造影剂注射即刻开始计时。结合逐帧回放模式回放动态图像,记录造影剂到达肝动脉时间（hepatic artery arrival time,HAAT）、造影剂到达门静脉时间（portal vein arrivaltime,PVAT）、造影剂到达肝静脉时间（hepatic vein arrival time,HVAT）,即相应血管内造影剂开始出现的时间。计算造影剂到达肝动脉与到达肝静脉间隔时间（HVAT-HAAT,VAT）、造影剂到达门静脉与到达肝静脉间隔时间（HVAT-PVAT,VVT）。进入TIC ANALYSIS程序,感兴趣区置于图像中场,获得肝实质时间—强度曲线,记录达峰时间、峰值强度、上升斜率、下降斜率。所有动物在超声检查后心脏取血5ml,检测肝纤维化血清学指标,包括HA、PCⅢ、C-Ⅳ和LN。切除肝组织以10%甲醛固定,石蜡包埋,进行HE染色、Masson染色、网状纤维染色,光镜下判定肝纤维化程度。Envision二步法进行C-Ⅳ、LN免疫组化染色。切除肝组织以2.5%戊二醛固定,常规制作电镜切片,透射电镜观察肝组织的超微结构。统计学分析以病理肝纤维化分期为依据进行分组,不同肝纤维化分期血清学指标、免疫组化结果、CEUS结果的比较采用单因素方差分析。血清学指标与免疫组化结果进行直线相关分析。CEUS结果与血清学指标、免疫组化结果进行直线相关分析。P＜0.05被认为有统计学意义。2、临床研究部分收集我院经肝组织穿刺活检确诊的慢性病毒性肝炎患者32例,其中男18例,女14例,年龄18-64岁,平均36.9岁。其中无纤维化组（S0期）7例,轻度肝纤维化组（S1期/S2期）11例,中度肝纤维化组（S3期）6例,重度肝纤维化组（S4期）8例,对照组6例,平均33.5岁。检测肝纤维化血清学直接指标:HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN。计算肝纤维化血清学间接指标APRI、Forns指数。Doppler超声测量肝动脉峰值血流速度（hepatic artery peak velocity,HAP）及阻力指数（hepatic artery resistive index,HARI）;门静脉直径（portal vein diameter,PVD）、门静脉峰值血流速度（portal vein peak velocity,PVP）;计算肝动脉/门静脉血流速度比值（HAP/PVP）。测量脾脏长径（spleen length,SPL）。CEUS检查:受检者仰卧位,在基波状态下于右肋间斜切面使门静脉及肝中静脉显示在同一切面上,切换至超声造影程序,按0.03ml/Kg剂量经肘静脉团注造影剂Sono Vue,从注射造影剂即刻开始计时。结合逐帧回放模式回放动态图像,记录HAAT、PVAT、HVAT,计算VAT、VVT。进入TIC ANALYSIS程序,感兴趣区置于图像中场,获得肝实质时间—强度曲线,记录达峰时间、峰值强度、上升斜率、下降斜率。统计学分析:不同组间各指标比较采用单因素方差分析。各指标与肝纤维化程度进行Spearman等级相关分析。对于组间比较差异有统计学意义的指标,分别以S＞1,S=4为判定肝纤维化和早期肝硬化的标准,应用ROC分析法评价其诊断肝纤维化的价值。P＜0.05被认为有统计学意义。结果1、动物实验部分对照组8只大鼠全部存活,光镜下肝小叶结构正常,无变性、坏死,无纤维间隔形成。进行造模的大鼠于给药4周后陆续开始出现死亡,按病理肝纤维化分期:S0期3只,S1期9只,S2期8只,S3期9只,S4期11只。随着造模时间的延长,肝细胞变性、坏死,逐渐形成纤维间隔,肝小叶结构紊乱,最终形成假小叶。电镜下见内皮细胞失窗孔,内皮下基底膜形成,同时内皮细胞周围出现大量胶原纤维。随着肝纤维化加重,C-Ⅳ、LN免疫组化染色阳性反应面积百分比增加,血清HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN水平随肝纤维化加重呈上升趋势。血清学HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN水平与C-Ⅳ、LN免疫组化表达呈正相关。对照组、S1期-S4期HAAT、PVAT两两比较差异无统计学意义;S3期、S4期HVAT、VAT、VVT较对照组、S1期、S2期缩短。肝实质时间-强度曲线分析:S3期、S4期峰值强度及下降斜率较对照组、S1期、S2期降低。HVAT与血清学指标HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN呈负相关,VAT、VVT与血清学指标HA、PCⅢ、LN呈负相关。肝实质时间-强度曲线峰值强度及下降斜率与血清学指标HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN呈负相关。HVAT、VAT、VVT与C-Ⅳ、LN免疫组化染色阳性反应面积百分比呈负相关。肝实质时间-强度曲线峰值强度、下降斜率与C-Ⅳ、LN免疫组化染色阳性反应面积百分比呈负相关。2、临床研究部分肝纤维化血清学直接指标HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN及间接指标APRI、Forns指数与肝纤维化程度呈正相关。ROC分析表明HA、PCⅢ、LN诊断早期肝硬化（S=4）的AUC为0.733～0.800（P＜0.05）,APRI、Forns指数诊断早期肝硬化的AUC分别为0.765（P＜0.05）、0.900（P＜0.05）。各组PVD、PVP、HAP、HAP/PVP、HARI、SPL比较差异无统计学意义。HVAT、VAT、VVT与肝纤维化程度呈负相关,中度及重度肝纤维化组HVAT、VAT、VVT缩短,ROC分析表明HVAT、VAT、VVT诊断早期肝硬化（S=4）的AUC为0.829～0.835（P＜0.05）。肝实质时间-强度曲线达峰时间与肝纤维化程度呈正相关,峰值强度、上升斜率、下降斜率与肝纤维化程度呈负相关,中度及重度肝纤维化组峰值强度、下降斜率减低,重度肝纤维化组达峰时间延后,上升斜率减低。ROC分析表明上升斜率及下降斜率诊断早期肝硬化的AUC为0.731（P＜0.05）及0.850（P＜0.05）。结论1、CEUS是安全的影像学检查方法,应用CEUS可以观察肝动脉、门静脉、肝静脉显影过程以及肝实质-时间强度曲线的变化特点,揭示肝纤维化血流动力学变化规律。2、CEUS在临床研究与动物实验中的结果具有一致性,肝纤维化S3期、S4期HVAT、VAT、VVT缩短,肝实质时间-强度曲线峰值强度、下降斜率减低等变化与肝窦毛细血管化及肝脏动脉血化、肝内分流形成等肝内血流动力学改变有关。3、CEUS指标有助于评价中、重度肝纤维化。CEUS缺乏早期诊断肝纤维化（S＞1）的能力,对早期肝硬化（S=4）诊断准确性中等。4、肝纤维化血清学直接指标及间接指标均不能早期诊断肝纤维化（S＞1）。直接指标HA、PCⅢ、LN及间接指标APRI、Forns指数对早期肝硬化（S=4）的诊断准确性中等。5、Doppler超声测量参数PVD、PVP、HAP、HAP/PVP、HARI在评估肝纤维化方面不是有价值的指标。