GSTs、CAT基因多态性与疾病易感性分析及功能研究

论文摘要

白癜风是临床常见的色素脱失性疾病,关于黑素细胞破坏或凋亡的病理机制众说纷纭,从若干角度提出研究假说,涉及遗传、自身免疫、神经介质、氧化应激、细胞毒作用、微环境紊乱等诸多方面。近年的研究表明,氧化应激产生大量活性氧自由基及脂质过氧化物等,在触发黑素细胞破坏或功能障碍方面扮演重要角色。氧化-抗氧化机制稳定的情况下,机体应对环境物理、化学刺激时,抗氧化剂能够迅速清除有害自由基,保护机体免受氧化损伤。具有特殊遗传背景（存在致病性遗传变异）的个体,黑素细胞抵御外界有害刺激能力下降,抗氧化机制失调,细胞容易发生坏死或凋亡。过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase GSTs）是重要的抗氧化酶,其编码基因变异有可能造成蛋白表达或功能异常。目前尚无抗氧化酶基因多态性与汉族人白癜风相关性的研究,因此我们以西北汉族人群为研究对象,通过大规模病例-对照研究,检测分析抗氧化酶编码基因CAT、GSTM1、GSTT1、GSTP1启动子区或外显子区重要单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphism SNP）位点的分布频率,探讨突变型个体与白癜风易感性的关系,并对启动子区SNP位点进行初步功能学研究,从分子机制初步阐述抗氧化酶基因遗传变异在白癜风发病中的作用,为白癜风机理研究和临床治疗提供线索和理论依据。方法本实验收集749例白癜风患者和763例正常人DNA样本,通过PCR-RFLP和多重PCR的方法检测了4个基因共8个SNP位点（GSTT1、GSTM1、GSTP1 Ile104Val、GSTP1 Ala113Val、GSTP1 Gly169Asp、CAT -89A>T、CAT 389C>T、CAT 419C>T）的基因型,SAS软件统计白癜风患者和正常人群中的分布频率,分析其与疾病的关联性。对CAT基因启动子区SNP进行初步功能学研究,构建含启动子区不同等位基因的重组质粒,瞬时转染细胞,利用荧光素酶报告基因分析启动子区单点突变对基因转录活性的影响,ELISA检测不同基因型个体血清中过氧化氢酶活性。结果1. GSTT1基因缺失型个体罹患白癜风的风险增高（校正OR 1.42, 95%可信区间1.16-1.75）,而GSTM1基因缺失仅表现为风险性增加趋势（P=0.059,校正OR 1.22, 95%可信区间0.99-1.49）;GSTT1/GSTM1联合基因缺失的个体更容易发生白癜风（校正OR 1.71, 95%可信区间1.28-2.28）。2. GSTP1基因3个多态性位点中,GSTP1 Ile104Val在白癜风患者和正常人群中分布无明显差异,GSTP1 Ala113Val和GSTP1 Gly169Asp在本研究样品中仅检测到极少数变异,提示不同种族间基因突变频率存在差异。3. CAT -89A>T位点等位基因在白癜风患者和正常人群中分布有显著差异,携带突变基因型的个体患病风险增高;CAT 389C>T位点与疾病无明显关系;CAT 419C>T位点在本研究入选样本中表现同质性。4. CAT -89A>T和CAT 389C>T存在协同作用,个体患病风险随等位基因突变个数增加而增加;CAT -89A>T和CAT 389C>T之间也有相互作用,CAT -89AT基因型个体常携带CAT 389 TT基因型,其患病风险大大增加（校正OR 1.71, 95%可信区间1.59–5.64）。5.经软件分析预测及荧光素酶报告基因分析,CAT -89A>T位点发生遗传变异（A→T）后,转录活性发生明显改变;含突变等位基因的序列可能结合转录因子Sp1,影响正常转录。6.同正常人群相比,白癜风患者血清中过氧化氢酶活性明显下降;CAT -89不同基因型个体血清过氧化氢酶活性无显著差异。结论1. GSTT1基因和GSTM1基因与汉族人白癜风有显著相关性,基因缺失的个体患病风险增高;GSTP1基因外显子区Ile104Val、Ala113Val和Gly169Asp 3个多态性位点对白癜风发病无明显影响。2. CAT -89A>T多态性位点与白癜风发病有密切关系,并协同外显子区389C>T位点共同影响疾病发生。3. CAT启动子区-89位点基因变异可能产生新的蛋白结合位点,或原有转录因子结合特性改变,但单独作用尚不能导致蛋白表达量明显改变。4.抗氧化酶基因变异可能影响酶蛋白表达或催化功能变异,机体应对氧化损伤能力降低,容易受攻击。进一步研究氧化-抗氧化系统中基因变异的分子机制,可为白癜风发病机理的研究和临床治疗提供线索和新方法。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 实验一 GSTs基因多态性与疾病关联研究
• 1 实验材料和主要仪器
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 CAT基因多态性关联分析及其功能研究
• 1 实验材料和主要仪器
• 1.1 实验仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 载体、细胞系
• 2 实验方法
• 2.1 CAT基因多态性与白癜风关联研究
• 2.2 CAT启动子区-89 位点转录调控功能检测
• 2.3 血清catalase活性分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢