利用插入失活法对2型猪链球菌毒力因子的研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis）是革兰阳性兼性厌氧球菌，是导致猪和其它家畜感染的主要病原菌之一，同时也可导致人的感染。1968年，丹麦首次报道猪链球菌引起的人体严重感染。1998年和2005年在中国爆发了两次大规模的猪链球菌病，造成猪大量死亡，并有人感染致死的情况发生。迄今为止，已有中国、美国、加拿大等许多国家报道了此类病例。猪链球菌病对人体健康的危害及造成的经济损失引起了社会的广泛关注。在根据猪链球菌荚膜多糖抗原差异所分的35种血清型中，2型猪链球菌（Streptococcus suis capsular Serotype 2，SS2）被认为是致病性最强的、流行最广的荚膜类型，可引起人的脑膜炎、心内膜炎、关节炎和败血症。而且，在中国人群爆发的猪链球菌病中，死亡的病例大多表现为罕见的中毒性休克综合症（TSS）。2型猪链球菌的致病性与其毒力因子有关，目前已知的毒力因子有荚膜多糖（CPS）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、胞外蛋白因子（EF）、溶血素（SLY）和粘附素（adhesin）等。然而其致病机制并不十分清楚，毒力因子也比较复杂。2005年SS2病在我国暴发流行后，我国中科院基因组研究所完成了1998、2005年暴发流行株的全基因精细图（98HAH12和05ZYH33），并通过将两株中国强毒株（98HAH12、05ZYH33）、一株欧洲强毒株（P1／7）和无毒株05HAS68进行了比较基因组分析，发现了一个长约89kb的毒力岛PAI，命名为89K，仅在中国流行株中存在，很可能是SS2中国流行株引起TSS并具有强毒力的原因。因此，我们选取猪链球菌05ZYH33基因组中89K毒力岛上的0910、0913、0936、0962、0975基因为研究对象，利用基因插入失活的方法，通过同源重组技术，构建缺失基因片段功能的插入失活突变株98HAH12△0910、05ZYH33△0910、05ZYH33△0913、05ZYH33△0936、05ZYH33△0962和05ZYH33△0975，并经动物试验验证其毒性。通过与野生株相比，失活了基因片段0910生物学功能的突变株毒力下降最为明显。0910为一个编码ABC转运蛋白的基因，为进一步了解0910的致病机制，我们通过分子生物学的方法构建0910-pET-32a（+）的融合基因表达载体，并将其转化BL21感受态中进行原核表达和纯化，制备0910融合蛋白，并用该融合蛋白免疫大鼠，经几次免疫后，取血清，测效价达到106，并通过全细胞ELISA的方法测定0910为编码细胞表面蛋白的基因，为进一步研究0910基因的功能及其在2型猪链球菌中所起的作用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词
• 第一章 前言
• 第二章 构建猪链球菌2型突变株及其生物学功能的鉴定
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 0910原核表达、抗体制备及0910蛋白定位
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 综述
• 发表文章
• 参考文献
• 致谢
• 附录