荷电脂质对重组细菌视紫红质蛋白活性的影响

论文摘要

细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin, BR)蛋白是嗜盐菌紫膜上的唯一蛋白,具有光驱质子泵活性。受到光激发时,BR蛋白将经过由K,L,M,N,O等瞬间中间态组成的光循环过程。M中间态对应于BR蛋白向胞外的质子释放过程。本论文利用去垢剂透析法将BR蛋白重组于不同处方、不同荷电脂质比例的脂质体中,研究了BR在非光照条件下输送氢离子的活性、荷电脂质对蛋白重组机制以及重组BR蛋白光循环活性的影响。细菌视紫红质蛋白在避光条件下,有助于氢离子的过膜扩散。这可能是因为:(1)BR具有质子通道作用,即使在非光照条件下,亦能输送氢离子过膜。(2)BR与脂质膜的结合致使脂质膜致密性改变。在脂质膜组分中加入阴离子脂质,BR脂质体的氢离子通透性随着阴离子电荷的增加而减小,当阴离子脂质比例达到20%时,BR脂质体的氢离子通透性甚至略低于空白脂质体。与此同时,阳离子脂质成分的添加亦降低了氢离子通透性,但随着其比例的增加(10%～30%),蛋白脂质体通透性基本不变。重组过程中,随着脂质膜中阳离子脂质比例的增加,膜上反向组装的BR蛋白的比例也随之增加。在阴离子脂质环境中,细菌视紫红质蛋白则倾向于正向组装;但是,即使在100%阴离子条件下,蛋白也不能完全实现正向排列。此发现表明电荷是BR重组过程中的重要影响因子,对膜蛋白体外研究模型的构建及优化提供了有效信息。不同处方的荷电蛋白脂质体上,细菌视紫红质蛋白的M态衰减曲线有所差异。随着脂质体中阳离子成分的增加(0～60%),其上重组BR蛋白的M态衰减时间也延长;而当增加阴离子比例时(0～60%),M中间态衰减时间缩短。我们推测,微环境中的离子浓度变化导致蛋白内的电荷分布改变,从而影响其光循环。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1. 细菌视紫红质蛋白
• 1.1 嗜盐菌（ Halophiles）概述
• 1.2 细菌视紫红质蛋白的结构
• 1.3 细菌视紫红质蛋白的质子泵机理
• 1.3.1 质子向胞外的释放
• 1.3.2 质子的提取
• 1.4 细菌视紫红质蛋白的应用
• 2. 蛋白重组脂质体的制备和研究
• 2.1 脂质膜的组成
• 2.2 蛋白重组脂质体的制备方法
• 3. 本论文的研究背景和主要内容
• 参考文献
• 第二章 细菌视紫红质蛋白的提取及蛋白脂质体的制备
• 1. 前言
• 2. 实验材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 缓冲溶液
• 2.3 实验仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 嗜盐菌Halobacterium salinarum R-1 的培养
• 2.4.2 紫膜蛋白的提取
• 2.4.3 BR 重组脂质体的制备
• 2.4.4 BR 重组脂质体的表征
• 2.4.5 BR 蛋白脂质体重组鉴定
• 2.4.5.1 紫外光谱扫描
• 2.4.5.2 蔗糖梯度离心
• 2.4.5.3 SDS-PAGE
• 3. 实验结果及讨论
• 3.1 细菌视紫红质蛋白的提取
• 3.2 紫外分光光度计分析
• 3.3 蔗糖梯度离心及SDS-PAGE
• 3.4 空白及蛋白脂质体的粒径比较
• 3.5 荷电蛋白脂质体的粒径比较
• 3.6 荷电蛋白脂质体电动电势（Zeta Potential）检测
• 4. 小结
• 参考文献
• 第三章 蛋白脂质体质子通透性研究
• 1. 前言
• 2. 实验材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 缓冲溶液
• 2.3 实验仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 pH～F415/450 标准曲线的绘制
• 2.4.2 蛋白脂质体质子通透性检测
• 3. 实验结果及讨论
• 3.1 pH～F415/450 标准曲线
• 3.2 重组蛋白脂质膜的氢离子通透性及中性脂质组分的影响
• 3.3 重组蛋白脂质膜的氢离子通透性及带电荷脂质组分的影响
• 3.4 膜上重组蛋白的结构变化及脂质体的泄漏
• 4. 小结
• 参考文献
• 第四章 荷电脂质对BR 蛋白脂质膜组装机制及蛋白M 态衰减曲线的影响
• 1. 前言
• 2. 实验材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 缓冲溶液
• 2.3 实验仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 蛋白脂质体的制备
• 2.4.2 检测脉冲光照下蛋白脂质体中 BR 的质子提取、释放过程及蛋白的M 态衰减曲线
• 2.4.3 持续光照下测定蛋白脂质体中BR 的质子泵活性
• 3. 实验结果及讨论
• 3.1 脉冲光照下荷电脂质体中BR 的质子提取及释放
• 3.2 持续光照下荷电脂质体中BR 的质子泵活性
• 3.3 阳离子脂质体中BR 蛋白N 中间态的变化
• 3.4 蛋白脂质体中荷电脂质含量与BR 蛋白M 态衰减曲线的关系
• 4. 小结
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 1. 本论文的主要结论及意义
• 2. 本论文的创新之处
• 3. 展望
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢