论文摘要
目的构建表达大鼠肾上腺髓质素（AM）基因的重组腺病毒载体,探讨其对骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖的影响。方法设计带酶切位点NotI ,HindⅢ的引物,以大鼠肾脏组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得AM基因全部序列并定向克隆至穿梭载体pShuttle-CMV,构建出重组穿梭质粒pShuttle-CMV-AM,经过NotI ,HindⅢ双酶切和DNA测序鉴定后,利用pShuttle-CMV-AM和腺病毒骨架载体pAdEasy-1在细菌BJ5183菌体内进行同源重组,卡那霉素筛选,构建出重组腺病毒质粒rhAdEasy-AM,重组腺病毒质粒经PacI酶切鉴定和PCR鉴定后,在工程菌XL 10-Gold菌体内大量扩增,重组腺病毒质粒后转染AD-293细胞,在AD-293细胞内进行腺病毒的包装扩增,制备病毒上清并测定其滴度,并感染大鼠骨髓间充质干细胞,用MTT方法评估其对MSCs增殖的影响。结果将AM cDNA正向连接到穿梭载体pShuttle-CMV上,NotI ,HindⅢ双酶切能切出579bp的的片段,DNA测序结果与Genebank上AM基因编码区完全一致,该重组质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在细菌BJ5183菌体内成功进行同源重组,并经PacI酶切鉴定,得到带有目的基因的大小为3.Okb或4.5kb的穿梭质粒的片段,测得重组腺病毒感染性滴度为1×109pfu/ml,经Western blot检测,AM在MSCs里有表达。并能够在低氧条件促进其增殖（缺氧组与缺氧+AM组相比,P<0.01）。结论本实验成功构建出携带AM cDNA的真核表达载体重组腺病毒rhAdEasy-AM;并且用该重组腺病毒对骨髓间充质干细胞进行转染,证明导入的AM基因可以在骨髓间充质干细胞中表达AM蛋白,并能够在低氧条件促进其增殖。
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