维甲酸诱导腭裂发生的Smad信号机制

论文摘要

腭裂（cleft palate，CP）是人类常见的先天性发育畸形，给患者及其家属带来极大的痛苦。探询腭裂的发病机制一直是口腔学领域研究的重点，但因其影响因素复杂，涉及多个方面，因此腭裂发生的确切病因至今仍未明确。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）是维生素A的代谢产物，在胚胎发育过程中，调节着细胞的增殖和分化。同时，atRA也是一种常见致畸物，过量的atRA会抑制腭突的融合。在生物体的许多系统中，包括胚胎的组织和细胞，atRA可以调控转化生长因子β（transforming growth factor-βs，TGF-βs）的表达，而且在细胞增殖和分化过程中，atRA和TGF-β信号途径之间的相互作用至关重要。TGF-β信号通路的关键传导分子为胞质蛋白Smads。Smads为与线虫Sma和果蝇Mad蛋白同源的蛋白家族，是目前唯一被发现的TGF-β受体作用的底物，其中Smad2和Smad3是受体调控蛋白，该分子在被TGF-β受体磷酸化后可将TGF-β信号向核内传递，调控目的基因的表达。Smad7是Smad信号途径的负调控因子，可以与TGF-β受体结合抑制Smad2和Smad3的磷酸化。目前，众多研究证实TGF-βs在腭突融合过程具有极其重要的作用。然而，在atRA抑制腭突融合过程中，是否通过对Smad信号途径的影响来干预TGF-βs的作用，国内外均未见报道。本研究通过器官培养和建立动物模型来观察atRA对小鼠腭发育的影响，探索在腭突融合过程中atRA对中嵴上皮（medial edge epithelial，MEE）细胞内Smad信号途径的影响，从而进一步的分析atRA诱发腭裂的发病机制。方法：1．试验分组取8周龄的昆明小鼠，雌雄比例为3:1合笼过夜，次日阴道栓阳性的记为妊娠0天（gestation 0 day，GD0），共获得GD0孕鼠48只。将这些孕鼠随机分为两组：第一组为器官培养组，共24只；第二组为动物模型组，共24只。2．器官培养atRA溶于二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）配成不同浓度，随BGJb培养基加入培养瓶。实验组分3组，atRA终浓度分别为1μM、5μM、10μM，以0.1％DMSO为对照组。在无菌条件下取器官培养组GD13胎鼠的双侧腭板，按照腭板前后方向将腭板成对的放在微孔滤膜上，并使两侧腭板的边缘相互接触。然后，将腭板和微孔滤膜一起放入盛有BGJb培养基的Grobstein器官培养皿中，置于37℃、5％CO2饱和湿度的恒温孵箱中培养。取培养24小时对照组和5μM实验组的腭板，用于Western blot检测MEE细胞内磷酸化Smad2（phospho-Smad2，P-Smad2）和磷酸化Smad3（phospho-Smad3，P-Smad3）以及Smad7表达水平的变化。腭板培养72h时，HE染色，观察各组腭板的组织学形态；并取对照组和5μM实验组的腭板，用于TUNEL技术和免疫组织化学研究，检测MEE细胞的凋亡情况和层粘连蛋白的表达水平。3．建立动物模型将动物模型组的孕鼠随机分为两组：第一组为对照组，共12只；第二组为实验组，共12只。在妊娠第10天下午1时，实验组管饲atRA剂量为100mg／kg，溶于0.2ml玉米油中。对照组管饲等体积玉米油。实验组和对照组的孕鼠分别于GD12、GD13、GD14、GD14.5、GD15和GD16六个时间点处死，剖腹取胚鼠，切取胚鼠头部，常规石蜡包埋，用于组织学观察。并选择GD14、GD14.5对照组和实验组良好的组织切片，用免疫组化染色检测P-Smad2在实验组和对照组腭突中表达的差异，进一步证实atRA对Smad信号途径影响，并由此推断出atRA的可能致畸原因。结果：1．atRA对腭突融合的影响器官培养组内HE染色结果显示：腭板培养72小时后，对照组的腭突完全融合；在atRA终浓度为1μM、5μM的实验组，两侧腭突接触，中缝上皮（midline epithelial seam，MES）持续存在；在atRA终浓度为10μM的实验组，腭突没有接触。动物模型组内HE染色结果显示：对照组腭突发育正常，双侧腭突完全融合。实验组的腭突上抬明显延迟，腭突发育瘦小，以至于两侧腭突不能在中线处接触融合。2．atRA中嵴上皮细胞凋亡和基底膜退化的影响器官培养组内TUNEL技术和免疫组织化学结果显示：腭板培养72小时后，在对照组内，腭突MEE细胞的迁移和凋亡以及MES内基底层的退化都具有明显的特征；在实验组内，5μM atRA可以抑制中嵴上皮细胞的凋亡和基底层细胞的退化，并且还能诱导腭突间充质细胞的调亡。3．atRA对MEE细胞内Smad信号途径的影响器官培养组内Western blot结果显示：腭板培养24小时后，对照组在腭突融合过程中，腭突MEE细胞内P-Smad2和P-Smad3的表达量很高，Smad7的表达却被抑制；相反，在atRA诱导的实验组，腭突MEE细胞内几乎检测不到P-Smad2和P-Smad3的表达，而Smad7的表达量很高。动物模型组内免疫组化结果显示：对照组胎鼠腭突在GD14，处于水平生长状态，P-Smad2在腭突外缘中嵴上皮细胞内着色明显；在GD14.5，腭突处于融合的过程中，MES还没有完全的的消失变得不连续，P-Smad2的表达也不连续，在MEE细胞迁移的口腔上皮和鼻上皮的三角区域P-Smad2的着色很明显。实验组胎鼠腭突在GD14和GD14.5，没有正常的上升、融合，腭突的上皮细胞中均检测不到P-Smad2的阳性表达。结论：1．在腭突融合过程中，atRA可抑制MES内MEE细胞的凋亡和基底膜的退化，从而导致腭裂的发生。2．在腭突水平生长阶段，atRA可抑制MEE细胞中Smad信号途径的转导，从而抑制MEE细胞的凋亡和基底膜的退化，导致腭裂的发生。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 维甲酸诱导腭裂发生的Smad信号机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述部分 TGF-β/Smad信号途径在腭突发育过程中的作用
• 参考文献
• 英文缩略词
• 致谢