结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与GyrA相互作用核心区域的研究

论文摘要

DNA螺旋酶是原核生物细胞存活所必须的基础酶类,是很多抗癌药物（喹诺酮类）和抗生素药物（新生霉素等）的天然作用靶标,在结核病防治中的有非常重要的作用。近年来螺旋酶在探讨基本生命活动和开发设计新型药物等方面成为研究热点。DNA螺旋酶是由A、B亚基共同组成的二源四聚体,目前关于结核分枝杆菌螺旋酶GyrA与GyrB相互作用研究并不深入,两亚基之间究竟以何种方式重组而具有全酶活性,其机理完全不清楚。本实验室已鉴定出结核分枝杆菌螺旋酶GyrB的Toprim结构域是与GyrA相互作用的关键区域。在此基础上,本课题计划构建GyrB系列缺失突变体,利用酵母双杂交、SPR仪检测等技术分析其与GyrA之间的相互作用,确定GyrB与GyrA相互作用的核心区域,为探明螺旋酶催化机理提供基础,为阐明螺旋酶在结核分枝杆菌生命活动中的调控功能以及结核病新药药物靶标的筛选开发提供依据,并促进结核病的防治。本课题的主要研究结果为：1、根据公布的gyrB基因序列,扩增突变体片段gyrB1-518、gyrB1-531、gyrB1-550、gyrB△531-550、gyrB△548-564；将扩增的的突变体基因构建的相应的表达载体pET28a和酵母载体pGADT7上；在GyrB1-564基础上继续构建GyrB1-550,GyrB1-531, GyrB1-518突变体,并表达纯化突变体蛋白质；2、酵母双杂交、SPR等实验结果证明：缺失C端的GyrB不能与GyrA相互作用,说明GyrB-CTD是其与GyrA相互作用的必需功能结构域。3、构建α螺旋缺失突变体GyrB△531-550,酵母双杂交等实验结果显示,531-550aaα螺旋的缺失导致GyrB与GyrA之间丧失相互作用活性,α螺旋531-550aa可能是GyrB与GyrA相互作用的一个核心区域。α螺旋531-550aa可能对GyrB二聚体的形成具有重要的意义。4、构建无规则卷曲缺失突变体GyrB△548-564,酵母双杂交等实验结果显示,548-564aa短肽缺失导致GyrB与GyrA之间相互作用活性减弱,548-564aa短肽可能起到空间上支持Toprimα/β构象的重要作用,并有可能与GyrB上其他功能域配合发挥作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩语表
• 1 前言
• 1.1 结核病现状
• 1.2 DNA拓扑异构酶分类
• 1.3 Topoisomerase Ⅱ的研究现状
• 1.4 DNA Topoisomerase Ⅱ互作蛋白研究进展
• 1.4.1 与Topoisomerase Ⅱ不同区域相互作用的蛋白
• 1.4.2 在减数分裂过程中与Topoisomerase Ⅱ相互作用的蛋白
• 1.4.3 在细胞中定位不同的相互作用蛋白
• 1.5 结核分枝杆菌Topoisomerase Ⅱ结构与功能作用
• 1.5.1 结核分枝杆菌Topoisomerase Ⅱ功能作用
• 1.5.2 Toprim结构域的功能与作用
• 1.6 蛋白质相互作用研究方法
• 1.6.1 酵母双杂交
• 1.6.2 pull down技术
• 1.6.3 等离子共振技术
• 1.6.4 免疫共沉淀
• 1.6.5 荧光共振能量转移
• 1.6.6 双分子荧光互补
• 1.6.7 蛋白质微阵列
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 培养基
• 3.1.2 各种分子生物学酶、常用试剂盒及常用试剂
• 3.1.3 溶液及缓冲液
• 3.1.4 仪器
• 3.1.5 质粒
• 3.1.6 菌株
• 3.2 方法
• 3.2.1 结核分枝杆菌螺旋酶GyrB及其系列缺失突变体的构建
• 3.2.2 结核分枝杆菌螺旋酶GyrB缺失突变体蛋白的表达与纯化
• 3.2.3 酵母双杂交实验检测结核分枝杆菌螺旋酶GyrA、GyrB之间相互作用
• 3.2.4 SPR方法检测结核分枝杆菌螺旋酶GyrA、GyrB之间的相互作用
• 3.2.5 GST pull down检测结核分枝杆菌螺旋酶GyrA、GyrB之间的相互作用
• 4 结果与分析
• 4.1 结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与GyrA相互作用区域的分析
• 4.2 各缺失突变体的构建及蛋白质的表达纯化
• 4.2.1 GyrB突变体的pET28a和pGADT7载体的构建
• 4.2.2 GyrB突变体蛋白质表达与纯化
• 4.2.3 pGEX-KG-gyrA载体构建及带GST-tag A亚基的表达纯化
• 4.3 酵母双杂交方法验证GyrA亚基与GyrB及其缺失突变体的相互作用
• 4.4 GST pull down技术验证GyrA与GyrB缺失突变体之间的相互作用
• 4.4.1 GST pull down检测GyrA与GyrB、GyrBΔ548-564相互作用
• 4.4.2 GST pull down检测GyrA与GyrB1-518、GyrB1-531相互作用
• 4.4.3 GST pull down检测GyrA与GyrB1-550、GyrBΔ531-550相互作用
• 4.5 表面等离子共振方法检测A亚基与缺失突变体之间的相互作用
• 4.5.1 GyrB结合活性趋势图及动力学常数
• 4.5.2 各缺失突变体结合活力与野生型比较趋势图
• 5 讨论
• 5.1 蛋白质二级结构在空间结构中的作用
• 5.2 α螺旋531-550在B亚基中的重要意义
• 5.3 GyrB-CTD在GyrA、GyrB重组过程的重要意义
• 5.4 548-564aa短肽结构在B亚基中的重要意义
• 5.5 Topoisomerase Ⅱ和药物靶标筛选
• 5.6 T-segment在DNA螺旋酶内的运输
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢