重组手性环氧化物水解酶的表达及其在手性环氧氯丙烷生产中的应用

论文摘要

环氧化物水解酶是一类存在于动物、植物以及微生物体内的水解酶,该酶能够立体选择性催化水解脂肪族、芳香族环氧化物生成相应水溶性邻二醇和光学纯环氧化物。环氧化物水解酶来源广泛,具有优良的对映体选择性和区域选择性。近年,微生物环氧化物水解酶已成为该领域的研究热点。对环氧化物水解酶开发和应用已受到广泛的关注,研究对象绝大多数是从自然界中筛选的野生菌株。虽然这些野生菌株都具有水解环氧化物的能力,但大部分野生菌株存在以下问题:对映体选择性不高,产率低等。为获得催化效率更高的环氧化物水解酶,重组环氧化物水解酶受到青睐。本文通过基因工程技术合成来源于Rhodosporidium toruloides CBS14的环氧化物水解酶基因,全长1230 bp,编码420个氨基酸。通过定向克隆环氧化物水解酶基因到表达载体pET28b,构建重组表达载体pET28b-EH,并将pET28b-EH转入大肠杆菌E.coli（BL21）,成功构建重组大肠杆菌E.coliBL21/pET28b-EH。重组菌经诱导表达,Ni-NAT柱分离纯化,SDS-PAGE分析结果显示,重组蛋白约为46.3kDa。经检测,重组菌对环氧氯丙烷的比酶活可达到14.45U/mg（drycell）。在成功构建产环氧化物水解酶基因工程菌的基础上,以环氧氯丙烷为底物对该重组环氧化物水解酶进行酶学性质研究,确定了该酶的最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃,在pH为7.5时,稳定性最好。该重组EH表现出的热稳定性并不理想,在25℃、35℃、45℃、55℃时,其半衰期分别为2.820h、0.917h、0.592h、0.319h。反应动力学常数:Vmax=0.0105mol/（L*min）,Km=0.5953 mol/1。同时研究了相关的金属离子对酶活的影响,得到结论为Li+能够提高酶活,Hg2+完全抑制该酶酶活,而表面活性剂吐温-20的加入量为5%（v/v）时效果最佳,酶活提高1.6倍。通过研究该酶拆分环氧氯丙烷的反应进程,反应40分钟后的e.es值为100%.为了将该酶进行扩大生产,我们采用响应面（RSM）分析法对摇瓶培养条件进行优化。通过旋转中心组合实验考查了葡萄糖、酵母粉和蛋白胨这三个因素对菌株所产环氧化物水解酶活力的影响。发酵培养基优化结果为:葡萄糖5.2g/l,酵母粉5.0g/l,蛋白胨32.4g/l,NaCl 10.0g/l,pH为7.0。采用优化后的发酵条件进行摇瓶发酵培养,环氧化物水解酶的酶活达到29.49U/ml,比优化前的初始发酵条件下的酶活（7.69U/ml）提高了 283.4%。以乳糖为诱导剂,摇瓶培养的最优条件为:诱导剂乳糖浓度为1.0g/l,28℃下诱导9h。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 环氧氯丙烷简介
• 1.1.1 环氧氯丙烷的性质和用途
• 1.1.2 环氧氯丙烷的生产方法
• 1.1.2.1 丙烯高温氯化法
• 1.1.2.2 醋酸丙烯酯法
• 1.1.2.3 甘油法
• 1.1.3 国内外的研究现状
• 1.2 手性环氧氯丙烷的生产方法
• 1.2.1 化学法
• 1.2.2 Salen手性催化剂的水解动力学拆分法
• 1.2.3 生物催化法
• 1.2.3.1 以外消旋环氧氯丙烷为底物的生物法合成
• 1.2.3.2 以二氯丙醇为底物的生物法合成
• 1.3 环氧化物水解酶
• 1.3.1 环氧化物水解酶的结构
• 1.3.2 环氧化物水解酶的催化反应机理
• 1.3.3 环氧化物水解酶的基因工程研究
• 1.3.3.1 环氧化物水解酶基因的克隆表达与改造
• 1.3.3.3 存在的问题
• 1.3.5 环氧化物水解酶的应用
• 1.3.6 展望
• 1.4 本论文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 产环氧化物水解酶基因工程菌的构建及其表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌种与质粒
• 2.2.2 试剂和仪器
• 2.2.2.1 试剂
• 2.2.2.2 仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 EH在大肠杆菌中的表达
• 2.2.4.1 质粒的提取
• 2.2.4.2 双酶切体系的建立
• 2.2.4.3 胶回收酶切片段
• 2.2.4.4 胶回收产物与pET-28b的连接
• 2.2.4.5 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.4.6 连接产物的转化
• 2.2.4.7 重组质粒的筛选及鉴定
• 2.2.4.8 EH基因的诱导表达
• 2.2.5 重组EH的酶活检测
• 2.2.6 环氧氯丙烷的定量分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 EH基因序列的合成及分析
• 2.3.1.1 EH基因序列的合成
• 2.3.1.2 序列比对
• 2.3.1.3 同源模拟和分子对接
• 2.3.2 环氧化物水解酶在大肠杆菌中的表达
• 2.3.2.1 重组表达载体的构建
• 2.3.2.2 重组EH酶活力的测定
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 重组手性环氧化物水解酶的分离纯化 及酶学性质表征
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种与培养基
• 3.2.2 主要仪器和试剂
• 3.2.3 菌种的制备
• 3.2.4 重组EH的分离纯化
• 3.2.5 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 EH的分离纯化
• 3.3.2 EH的酶学性质
• 3.3.2.1 pH对酶活性的影响
• 3.3.2.2 pH稳定性
• 3.3.2.3 温度对酶活性的影响
• 3.3.2.4 酶的温度稳定性
• 3.3.2.5 金属离子对酶活力的影响
• 3.3.2.6 表面活性剂对酶活力的影响
• 3.3.2.7 反应动力学
• 3.3.2.8 环氧氯丙烷的拆分动力学过程
• 3.3.2.9 底物特异性
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 环氧化物水解酶产生菌E.coli培养条件优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 培养方法
• 4.2.5 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 种子液生长过程曲线及种龄的确定
• 4.3.2 摇瓶发酵培养基及诱导条件优化
• 4.3.2.1 葡萄糖浓度的优化
• 4.3.2.2 氮源优化
• 4.3.2.2.1 有机氮源优化
• 4.3.2.2.2 无机氮源优化
• 4.3.2.3 金属离子
• 4.3.2.4 乳糖诱导量条件优化
• 4.3.2.5 培养基中磷酸盐浓度的优化
• 4.3.2.6 诱导时机条件优化
• 4.3.2.7 诱导时间条件优化
• 4.3.2.8 摇瓶发酵培养基的确定
• 4.3.2.9 验证试验
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 附录
• 攻读硕士期间发表论文情况
• 致谢