黑三棱破血消癥作用的药理机制及活性成分研究

论文摘要

黑三棱（Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.）是传统破血消癥中草药,其治疗瘤瘕、痞块、瘀血、经闭以及食积胀痛疗效十分明确。虽然目前已经从黑三棱的干燥块茎提取物中分离得到十几种化合物,但这些化合物的总含量较低（干重<0.009‰）且均不溶于水,因此,黑三棱药理活性的起效成分尚不明确,目前国内外对黑三棱的有效成分及药理研究也尚不深入。本研究首次选择黑三棱适应症病理所共同的血管生成分子机制与内分泌分子机制为研究基础,比较100、200、400 mg/kg/d的黑三棱提取物在清洁级ICR品系怀孕小鼠8.5～18.5dpc致畸敏感期经口给药时的生殖毒理作用。研究结果显示：与对照组相比,400 mg/kg/d组孕鼠妊娠期明显缩短（0.5～1.0 dpc）、平均产仔数下降、平均仔鼠出生体重与21 dpp断乳体重减轻、仔鼠性别比异常,2.9%的仔鼠出现脐带部位粉脂瘤及5.1%的仔鼠表现为趾骨发育异常；在400 mg/kg/d实验组中,有13.3%的雌性亲本在仔鼠断乳后的45 d内表现为子宫腺体增生及死亡,显著高于对照组（0%）；而13.5 dpc时的400 mg/kg/d组胚胎与对照组相比,平均VEGF（P<0.05）及FGF（P<0.01）的表达水平显著降低而平均雌激素受体（estrogen receptor, ER）的表达水平显著增高（P<0.01）,且在相同胚胎中,ER表达水平的升高与FGF的表达水平的降低呈线性相关（P<0.01）；此外,13.5 dpc时的400 mg/kg/d组胚胎与对照组相比,也表现为较高的心脏（12.9%）、颅面（18.3%）及椎体（32.5%）发育异常。所得黑三棱提取物的生殖毒理学研究结果证实,黑三棱提取物在特殊的生理时期的确具有显著的毒理作用,黑三棱的活性成分表现为罕见的天然植物雌激素拮抗剂药理活性,其诱导的毒理机制为雌激素拮抗导致的FGF信号通路异常和FGF.VEGF表达降低导致的血管生成障碍双重作用。由于血管生成机制与内分泌调控机制对肿瘤细胞的生长非常重要,血管生成拮抗作用导致的供养障碍与雌激素拮抗作用导致的细胞周期停滞均可显著抑制ER+肿瘤细胞的生长,因此,进一步的研究比较了不同浓度R.Spa.-W-hydro处理下,黑三棱诱导四种ER+肿瘤细胞毒理结果差异,证实：高于188μg/mL的R. Spa.-W-hydro处理对HeLa、MCF-7、A549、HepG-2四种ER+细胞均可产生明确的毒理作用,与添加1%甲醇的培养基处理细胞对照组相比,试验组在48 h内可显著抑制四种ER+细胞的增殖活性（P<0.01）,导致细胞形态改变、接触生长状态消失,A549、MCF-7细胞微丝微管骨架异常,并显著诱导HeLa细胞凋亡（P<0.01）；750μg/mL组处理36h时可显著诱导A549、MCF-7细胞的S/G2细胞周期停滞,HepG-2细胞的G1细胞周期停滞与HeLa细胞的M期细胞比率下降。研究进一步比较了分别以水提（R. Spa.-W-hydro）,75%甲醇浸提（R.Spa.-M75）,100%甲醇浸提（R. Spa.-M100）,乙酸乙酯萃取（R. Spa.-W-lipo）方法制备的黑三棱提取物的抗HeLa宫颈癌活性差异以及不同提取物活性成分的HPLC图谱,在相同黑三棱生药浓度下,MTT与免疫荧光细胞骨架的研究结果证实,除R. Spa.-W-lipo外,R. Spa.-W-hydro、R. Spa.-Me75、R. Spa.-Me100三种黑三棱提取物均表现为显著的抑制HeLa细胞增殖活性、诱导细胞接触生长状态消失、细胞骨架皱缩以及细胞形态异常的毒理现象,其毒理作用强度为R. Spa.-W-hydro>R. Spa.-Me75>R. Spa.-Me100;黑三棱的R. Spa.-W-hydro与R. Spa.-Me100提取物HPLC图谱分析共识别到18个色谱峰,其中10个为共有峰,7个表现为与提取物的抗癌活性强度相关的含量变化。使用正向柱层析方法从抗HeLa宫颈癌活性最高的黑三棱R. Spa.-W-hydro提取物中分离鉴定到一个新的生物碱糖甙“铝络合黑三棱碱三糖甙”（化合物Ⅰ）,一个含N碳水化合物以及七个化合物Ⅰ的分解产物（Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅷ,Ⅸ,Ⅹ）。其中,化合物Ⅰ是一个新的生物碱糖甙,也是第一个分离自黑三棱的生物碱,其提取率达5.99%（干重/生药干重）,占黑三棱R. Spa.-W-hydro提取物干重的61.4%以上。进一步的HPLC研究结果证实,化合物Ⅰ与R. Spa.-W-hydro HPLC图谱的8号主峰（峰面积29.32%）的出峰时间一致,所得结果为黑三棱药材的进一步药理研究及质量控制改良提供了重要的基础研究数据。此外,化合物Ⅰ结构的确认也证实了一个铝复合有机物在高等植物中的大量存在,具有重要的学术价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1. 中药黑三棱概述
• 1.1 中药黑三棱的性状、分类与药用价值
• 1.2 中药黑三棱的药理活性研究现状
• 1.3 黑三棱的天然药物化学研究现状
• 1.4 治疗癥瘕积聚类传统药物的研究现状
• 2. 血管生成（angiogenesis）的分子机制与相关药理研究现状
• 2.1 血管生成的分子机制
• 2.2 血管生成机制相关药理研究现状
• 3. 内分泌辅助治疗（endocrine adjunctive therapy）的相关研究
• 4. 本研究的目的与意义
• 第二章 黑三棱提取物抑制鼠胚血管生成的毒理机制研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 试剂与设备
• 1.2 动物模型制备
• 1.3 黑三棱提取物制备
• 1.4 黑三棱对孕鼠亲本及子代的生殖毒理实验
• 1.5 小鼠胚胎组织切片的血管生长因子免疫组织化学分析
• 1.6 统计分析方法
• 2. 结果
• 2.1 黑三棱提取物诱导仔鼠生殖毒理实验结果
• 2.2 黑三棱提取物诱导孕鼠亲本毒理实验结果
• 2.3 黑三棱提取物诱导胚胎毒理机制的研究结果
• 3. 小结
• 第三章 黑三棱提取物对四种ER+恶性肿瘤细胞系的毒理作用
• 1. 材料与方法
• 1.1 试剂与设备
• 1.2 药物培养基的制备
• 1.3 细胞培养
• 1.4 MTT法检测细胞增殖活性
• 1.5 细胞光度术（FCM）检测细胞周期
• 1.6 间接免疫荧光法分析细胞骨架
• 1.7 统计学处理
• 2. 结果
• 2.1 细胞生长曲线的测定（MTT）
• 2.2 细胞凋亡结果（流式细胞光度术,FCM）
• 2.3 细胞周期（DNA content）
• 2.4 细胞形态
• 3. 小结
• 第四章 黑三棱抗HELA宫颈癌活性成分的HPLC分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 黑三棱不同提取物的制备
• 1.2 实验设备
• 1.3 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 黑三棱不同提取物的黄酮反应鉴定
• 2.2 黑三棱不同提取物的生物碱反应鉴定
• 2.3 黑三棱不同提取物的HeLa细胞毒理研究
• 2.4 黑三棱提取物诱导下HeLa细胞骨架形态研究
• 2.5 黑三棱抗HeLa宫颈癌活性成分的HPLC分析
• 3. 小结
• 第五章 黑三棱活性成分的天然药物化学分析
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 2.1 黑三棱提取物R.Spa.-W-hydro的TOF-MS分析
• 2.2 黑三棱提取物R.Spa.-W-hydro的分离鉴定结果
• 2.3 R.Spa.-W-hydro主要化合物的HPLC研究
• 2.4 不同批次黑三棱铝元素的含量测定结果
• 3. 小结
• 讨论
• 研究的创新点
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢