荧光假单胞菌蛋白酶水解牛乳特性及免疫功能研究

论文摘要

为了初步探索荧光假单胞菌蛋白酶（Pseudomonas Fluorescens Protease,PFP）水解牛乳的特性以及水解物的免疫活性,先就PFP对牛乳中主要蛋白质的水解特性进行了试验研究,确定了水解的最佳条件,并在此基础上,进一步研究了牛乳的PFP水解物对小鼠免疫功能的影响。本试验研究包括以下三个部分:1.PFP酶学性质的初步研究:对PFP的含量、活性、酶的最适温度及pH值进行了研究。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE）确定了经过盐析、超滤、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析后的蛋白酶达到了电泳纯;通过考马斯亮蓝法测定酶的含量;通过偶氮酪蛋白法测定酶的活性及酶的最佳温度与pH值。结果表明:得到的PFP为电泳纯蛋白酶;酶的含量为62.37μg/mL;酶的活性为17333 U/mL;酶的最佳温度为40℃,最佳pH值为7.5。2.PFP水解牛乳蛋白特性的研究:就PFP对牛乳中主要六种蛋白质的水解特性进行了试验研究,确定了形成免疫活性肽的最佳条件。PFP水解牛乳中六种蛋白质后形成的水解物分别用SDS-PAGE和反相高效液相色谱（Reverse phase-highperformance liquid chromatograph,RP-HPLC）法检测,通过正交试验优化了水解工艺参数。结果表明:αs-CN、β-CN、κ-CN均在PFP作用下得以水解,而BSA、α-la、β-lg三种乳清蛋白均未被水解。以RP-HPLC方法对PFP水解酪蛋白形成的免疫活性肽的测定,在通过210 nm处检测最大吸收峰面积得出最佳水解工艺参数:水解时间为3 h、水解pH 6.5、水解温度40℃、蛋白酶与底物浓度比为1:200（v/v）。3.PFP水解脱脂乳粉产物免疫活性的研究:试验研究了脱脂乳粉的PFP水解物对小鼠免疫功能的影响。受试小鼠分别灌喂生理盐水、低剂量（100 mg/Kg.bw）及高剂量（250 mg/Kg.bw）PFP水解脱脂乳粉形成的水解产物,30 d后测定小鼠免疫活性指标,就水解物对小鼠免疫功能的影响进行了试验研究。结果显示:高、低剂量饲喂对小鼠生长均无显著影响;低剂量饲喂可增强脾脏指数（P＜0.05）,而对胸腺指数影响不明显;高剂量饲喂可增强单核巨噬细胞吞噬功能（P＜0.05）;低剂量饲喂24 h及高剂量饲喂48 h均显著提高小鼠迟发型变态反应（P＜0.05）,而低剂量饲喂48 h及高剂量饲喂24 h小鼠迟发型变态反应及抗体细胞生成能力均有极显著的增强作用（P＜0.01）;表明脱脂乳粉的PFP水解物可以提高小鼠免疫功能。通过完成三个部分的试验研究,可以得出PFP是一种对热有一定的耐受性的蛋白酶,该蛋白酶可水解牛乳中的酪蛋白,但不水解乳清蛋白,且水解物均含有免疫活性肽。PFP对酪蛋白酶解形成免疫活性肽的水解时间为3 h、水解PH 6.5、水解温度40℃,酶与底物浓度比为1:200（v/v）;PFP水解脱脂乳粉物可以促进小鼠免疫器官的发育、刺激吞噬细胞的吞噬功能、增强迟发性变态反应以及增加抗体的生成数,因此可以提高小鼠免疫功能。本研究对PFP的合理利用提供了一条新的思路,同时为免疫活性肽的形成提供一条可行的技术思路,并丰富了牛乳源免疫活性肽的内容。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 课题的提出
• 2 牛乳源免疫活性肽及其进展
• 2.1 牛乳中游离的生物活性肽
• 2.2 动物源蛋白酶水解后形成的免疫活性肽
• 2.2.1 胰蛋白酶水解后形成的免疫活性肽
• 2.2.2 胃蛋白酶水解后形成的免疫活性肽
• 2.2.3 凝乳酶水解后形成的免疫活性肽
• 2.2.4 其他动、植物及微生物蛋白酶水解后形成的免疫活性肽
• 2.3 食品发酵过程中形成的免疫活性肽
• 2.4 牛乳源免疫活性肽的应用及研究展望
• 3 牛乳源活性肽的免疫调节活性
• 3.1 前言
• 3.2 对免疫器官生长发育的影响
• 3.3 对免疫细胞增殖与活性的影响
• 3.3.1 对免疫活性细胞增殖与活性的影响
• 3.3.2 对免疫辅佐细胞的影响
• 3.4 对免疫因子增值与活性的影响
• 3.4.1 对细胞因子增值与活性的影响
• 3.4.2 对补体及抗体的影响
• 3.5 牛乳源免疫活性肽的重要性
• 4 本研究的目的、意义、创新点以及技术路线
• 第二章 PFP酶学特性初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 蛋白酶
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 酶电泳纯的鉴定
• 1.2.2 蛋白质含量的测定（Bradford，1976）
• 1.2.3 酶活性的测定（Secades et al.，2001）
• 1.2.4 酶最佳温度的选择
• 1.2.5 酶最佳pH的选择
• 2 结果与分析
• 2.1 PFP电泳纯鉴定
• 2.2 PFP蛋白含量结果与分析
• 2.3 酶最佳温度与pH值的确定
• 2.3.1 PFP最佳温度的确定
• 2.3.2 PFP最佳pH的确定
• 3 讨论
• 第三章 PFP水解牛乳蛋白特性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 蛋白酶
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 SDS-PAGE对PFP水解牛乳中主要蛋白质的分析
• 1.2.2 RP-HPLC对免疫活性肽标准品的鉴定
• 1.2.3 RP-HPLC对PFP水解酪蛋白的分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PFP水解牛乳中主要蛋白质的SDS-PAGE分析
• 2.1.1 三种乳清蛋白的SDS-PAGE图谱
• 2.1.2 三种酪蛋白的SDS-PAGE图谱
• 2.1.3 PFP对牛乳中主要蛋白质水解情况
• 2.2 RP-HPLC对免疫活性肽标准品的分析
• 2.3 PFP水解酪蛋白的RP-HPLC分析
• 2.3.1 正交法优选PFP水解酪蛋白结果
• 2.3.2 水解物免疫活性肽的鉴定
• 3 讨论
• 第四章 PFP水解脱脂乳粉的免疫功能实验
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 免疫活性肽
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 动物的管理及饲喂方法
• 1.2.2 小鼠体重、免疫器官重及免疫器官指数实验
• 1.2.3 小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的测定（碳廓清实验）
• 1.2.4 小鼠迟发性变态反应（DTH）的测定（足趾增厚法）
• 1.2.5 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）
• 2 结果与分析
• 2.1 对小鼠体重、免疫器官重及免疫器官指数影响
• 2.1.1 对小鼠体重的影响
• 2.1.2 对免疫器宫和免疫器官指数的影响
• 2.2 对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响
• 2.3 对小鼠迟发性变态反应的影响
• 2.3.1 对24h小鼠迟发性变态反应的影响
• 2.3.2 对48h小鼠迟发性变态反应的影响
• 2.4 对抗体生成细胞的影响
• 3 讨论
• 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 试验图谱