雷公藤内酯醇诱导人骨髓增生异常综合征MUTZ-1细胞凋亡及其机理研究

论文摘要

[目的] 骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的造血干细胞疾病,以外周血细胞减少,骨髓增生异常和易于向急性白血病转化为特点。MDS可被视为一种癌前状态,病人通常有三种结局:带病存活较长时间,死于严重血细胞减少带来的并发症或是疾病向急性白血病转化。目前认为,MDS的发病是一个多步骤的过程,基因突变、免疫紊乱、染色体异常以及环境因素皆参与其中。所以治疗上应以清除恶性克隆,恢复正常造血和调节机体免疫为目标。雷公藤内酯醇（triptolide,TPL）是从传统中药卫矛科雷公藤属雷公藤中提取的活性成分,临床已经广泛用于自身免疫性疾病,如类风湿关节炎、肾炎、红斑狼疮等的治疗。近来研究发现TPL还具有显著的抗肿瘤功效,临床与实验研究均表明其对白血病亦有较好疗效。但其对MDS的作用未见报道。本实验旨在研究TPL对MDS细胞株MUTZ-1的作用并探讨其可能机制,为临床应用提供理论依据。浙江大学硕士学位论文l技术路线]1.采用MTT比色法研究TPL对人MDS细胞株MUTZ一1细胞体外生长的抑制作用,透射电镜观察细胞形态,DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡的特征性梯形条带,以及内叻exinV用I双标流式细胞仪技术检测凋亡的细胞量。2.应用Westem一blot法检测TpL作用下MUTz一1细胞easpase一3,一8,一9和pARp蛋白的活性变化。3.半定量逆转录酶一多聚酶链式反应（RT一PCR）检测TPL对MUTZ一1细胞凋亡蛋白抑制因子XIAP、c一IAPI、c一IAPZ mRNA表达水平的影响。4.Westem一blot法检测TPL对MUTZ一l细胞凋亡蛋白抑制因子XIAP、c一IAPI、c一IAPZ蛋白表达水平的影响。I结果l1.TPL抑制MUTz一1细胞生长,呈浓度依赖性: MTT比色法检测结果显示,20一80ng/m 1 TPL处理MuTZ-1细胞24h、48h,72h,除Zong/ml组外,其余浓度组与对照组相比,皆能明显抑制细胞增殖,差异具有统计学意义（P<0.001）。且生长抑制率与药物作用浓度正相关（P<0.01）。TPL处理细胞24h、48h、72h后,其ICS。分别为ss.o6ng/ml;48.6ong/ml;22.57ng/ml.2.TPL诱导MUTZ一1细胞凋亡,呈浓度依赖性: 采用透射电镜观察TPL作用前后MUTZ一1细胞形态,结果显示,20一60ng/ml的TPL处理24h后,MUTz一1细胞出现凋亡细胞典型的形态学特征,如胞浆空泡化,细胞体积缩小,细胞核染色质高度凝聚、边缘化;细胞核裂解为碎块,凋亡小体形成等.DNAladder结果显示,60ng/mlTPL作用24h可见典型的DNA浙江大学硕士学位论文梯形条带。AnnexinV爪I双标流式细胞仪技术检测了磷脂酞丝氨酸（PS）转位结果显示:20,4 0,60ng/ml TPL作用MUTZ一1细胞24h,凋亡细胞百分比分别为:9.99%,31 .25%,52.3%（空白对照组为2.71%）。细胞凋亡率与药物作用浓度正相关（r=0.985:P=0.015）。3.TPL通过激活casPase一3,一8,一9;酶切PA”蛋白诱导MUTZ一1细胞凋亡: TP以20一60ng/ml)作用于MUTZ一1细胞12小时,可见明显的caspase一3,一8,一9和PA即蛋白的激活带,且随药物浓度增大,casPase一3,一8,P ARI,原酶表达量下降,酶切片断eleaved easpase一3,一8,一9,cleaved pARP的表达量明显上升。TpL上调deaved casPase一9的同时,还能显著促进procasPase一9的蛋白表达增加。caspase一3,一8,一9,PAR卫蛋白表达量与TPL作用浓度相关（P<0.05）。4.TPL对MUTz一1细胞凋亡蛋白抑制因子基因mRNA水平表达的影响: 在MuTZ一1细胞中,c一IAPI,c一IAPZ和xIAP都存在一定的mRNA水平表达。MUTz一1细胞经TPL（20一60ng/ml）处理12h后,随着TPL浓度的增加,细胞c一IAPZ mRNA下调,与对照组相比,,差异具有显著性（P<0.01）;c一IAPZ表达与TPL浓度呈负相关（二一0.971,P=0.029）。5.TPL对MuTz一1细胞凋亡蛋白抑制因子基因蛋白水平表达的影响: 在MUTz一1细胞中,。·IAPI,。一IAPZ和xIAP都存在一定的蛋白水平表达。不同浓度TPL作用于MUTZ一1细胞1 Zh后,c一IAPI,c一IAPZ的蛋白表达水平显著下降,c一IAPI,。一IAPZ蛋白表达水平与TPL浓度之间存在负相关（r卜一0.997,P=0.003:‘=一0.991,P=0.009）。easpase一3,一9的激活与IApZ的表达下调相关 （:l=一0.975,P=0.025::2=一0.961,P=0,039）。提示TPL能够下调。一IAPI、e一I妙2蛋白的表达,解除其对caspase的抑制,促进凋亡。 3

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、论文正文
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 四、综述
• 五、致谢