无芒隐子草（Cleistogenes songorica）种质抗旱评价、cDNA文库构建及相关基因克隆与鉴定

论文摘要

野生植物携带有潜在的特异基因和变异基因,通过功能基因组的研究和基因挖掘,可揭示此类植物适应环境胁迫的特异机制,为农作物和草类植物的基因改良奠定基础。无芒隐子草（Cleistogenes songorica）为旱生性多年生草类,其极端抗旱性及作为沙漠草原恢复重建种的潜在价值已逐渐得到认可。本研究从收集我国极抗旱野生无芒隐子草种质资源、分析种质抗旱特性基础上,构建其干旱胁迫诱导cDNA文库;通过高通量测序技术平台获得大量cDNA序列;通过高性能生物信息学平台挖掘无芒隐子草抗旱功能基因组信息,进行抗旱相关基因的表达产物分析、转基因模式植物（拟南芥）的功能验证,确定目标基因的功能,为这些基因在草类作物遗传改良中的利用奠定基础。主要结论如下。收集到我国16份野生无芒隐子草种质资源,采用RAPD标记分析了无芒隐子草种群遗传多样性。用筛选得到的7个随机引物,共扩增出52条DNA片段,其中23条为多态性片段。分子变异分析（AMOVA）结果显示,种群间的变异占总变异的53.19%,种群内不同个体间的变异占总变异的46.81%,种群间的变异存在着显著性差异（P＜0.001）。聚类分析将无芒隐子草16个种群大致划分为3个聚类组:第一个聚类组包括10个种群,即:pop1～pop5、pop7、pop13～pop16;第2个聚类组包括pop6、pop8、pop11和pop12;第3个聚类组包括pop9和pop10。以无芒隐子草遗传差异较大的三个种群CS01,CS09和CS15为材料,通过观察其幼苗体内水分、光合作用参数、叶绿素荧光参数和光合色素等特征,研究其在持续干旱及复水期间忍耐极端干旱的保护机制。证实这三个种群响应干旱胁迫能力存在差异。干旱胁迫过程中,无芒隐子草仍保持相对较高的叶片相对含水量（75%）和叶水势（-3.2 MPa）,属于高水势耐旱型植物;光合器官和光合色素含量在干旱胁迫下受到严重影响;而光化学器官的功能影响不大,除PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm略有下降外,其它光化学参数都变化不大。无芒隐子草在持续缺水的环境下,光合速率持续下降,而胞间CO2浓度变化却不明显,两者变化方向不一致,故初步判断无芒隐子草净光合速率下降归因于叶肉细胞同化能力的降低。采用SMART技术,构建了无芒隐子草的轻度干旱胁迫根和叶、极度干旱胁迫根和叶共4个cDNA文库,文库Cs01L、Cs02R、Cs03L和Cs04R的重组率分别为78.6%、100%、78.6%和71.4%,插入片段大小在0.2～2.8kb之间。采用5’端随机测序的策略对无芒隐子草不同材料来源的全长cDNA文库进行了测序,共获得5664条序列。去除载体和污染序列,并将50bp以下序列剔除后共计获得3579条高质量序列,总序列长度达到2,191,166bp,平均每个EST长度为613bp。把获得的高质量EST使用phrap进行组装和去冗余后获得1499个重叠群,包括805个独立非冗余序列和694个多成员非冗余序列。基因功能注释（GO）采用与UniProt蛋白质数据库的匹配,60%（899条）无芒隐子草序列得到GO功能注释术语。这些GO术语中包含分子功能、生物过程、细胞组分三个层次,分别占22%、46%和32%。功能注释显示胁迫响应基因63个,其中与抗旱密切相关的基因25个。使用国际上通用的SSR引物设计软件,对1499个无芒隐子草EST（长度共计1.03Mb）进行了SSR分子标记的鉴定,共找到161个SSR特异分子标记。采用RACE法等相关技术进一步克隆无芒隐子草22个抗旱相关基因全长序列,已经获得全长序列10个。geNorm程序获得无芒隐子草7个内参基因的表达稳定度由高到低依次为:CsEIF52＞CsEIF51＞CsGAPDH＞CsActin-11＞CsUBQ＞CsTUA2＞CsHistone,以表达相对最稳定的3个内参基因GAPDH、CsEIF51、CsEIF52获得定量PCR实验中相对定量或绝对定量数据的所有标准化因子,以标准化因子对全部数据进行标准化。通过RT—PCR、qPCR相对定量来鉴定无隐子芒草22个抗旱相关基因的表达,发现有8个基因的表达是由干旱胁迫诱导的,并且受干旱胁迫的差异调控较显著,在胁迫过的根和叶中的表达都较对照增加3倍以上;qPCR绝对定量进一步研究7个基因在不同组织、不同胁迫处理（干旱胁迫0天、4天、6天、8天、10天、以及恢复浇水后1天和4天共7个关键时间点）的表达情况,揭示了这些基因在适应干旱环境过程中的表达调控机制。CsALDH基因在干旱胁迫下根系中相对表达量是对照的17倍。相对定量和绝对定量结果显示CsLEA2基因只在胁迫诱导下才表达,此基因在胁迫4天后的根中低水平表达,胁迫6天后根和叶中的表达量逐渐增大,干旱胁迫最大的第8天和第10天表达量达到了最大值;无芒隐子草恢复浇水后,基因表达量显著降低,直至浇水后第4天植物恢复正常生长时此基因表达消失。应用Gateway克隆技术,将CsALDH和CsLEA2基因分别与强组成型启动子CaMV 35S和胁迫诱导型启动子rd29A融合,构建了这两个基因的两种植物表达载体,并获得了拟南芥转基因植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗旱机制
• 1.1.1 躲旱型
• 1.1.2 避旱型
• 1.1.3 耐旱型
• 1.2 植物抗旱功能基因组研究
• 1.2.1 植物功能基因组学主要研究内容
• 1.2.2 植物及牧草抗旱功能基因组研究
• 1.3 cDNA文库的构建
• 1.3.1 cDNA文库的构建方法
• 1.3.2 cDNA文库的应用
• 1.3.3 草类作物全长cDNA克隆与测序研究进展
• 1.4 EST技术及应用
• 1.4.1 EST技术概述
• 1.4.2 EST技术的应用
• 1.4.3 生物信息学在EST研究中的应用
• 1.4.4 重要农作物及草类作物EST研究进展
• 1.5 基因工程改良草类种质资源
• 1.6 无芒隐子草研究进展
• 1.7 本研究技术路线
• 第二章 无芒隐子草野生种群遗传多样性RAPD分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 无芒隐子草种质资源的收集
• 2.2.2 DNA的提取与检测
• 2.2.3 PCR扩增与引物筛选
• 2.2.4 数据分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 无芒隐子草种群的DNA多态性分析
• 2.3.2 Shannon信息指数估计遗传多样性
• 2.3.3 Nei指数估计的基因多样性
• 2.3.4 分子变异分析（AMOVA）
• 2.3.5 聚类分析
• 2.4 讨论
• 第三章 无芒隐子草幼苗干旱胁迫特性研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 干旱胁迫处理
• 3.2.3 土壤含水量、叶水势、叶片相对含水量测定
• 3.2.4 叶片气体交换测定
• 3.2.5 叶绿素荧光测定
• 3.2.6 色素含量测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 土壤含水量、叶水势、叶片相对含水量变化特征
• 3.3.2 不同水分条件下叶片气体交换变化特征
• 3.3.3 叶绿素荧光变化特征
• 3.3.4 色素含量变化
• 3.4 讨论
• 第四章 无芒隐子草cDNA文库构建及ESTs分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 无芒隐子草干旱胁迫试验
• 4.2.2 无芒隐子草cDNA文库的构建
• 4.2.3 表达序列标签（ESTs）分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 无芒隐子草干旱胁迫试验
• 4.3.2 无芒隐子草cDNA文库的构建
• 4.3.3 表达序列标签（ESTs）分析
• 4.4 讨论
• 第五章 无芒隐子草抗旱相关基因全长cDNA克隆及表达分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 抗旱相关基因全长cDNA克隆
• 5.2.2 无芒隐子草抗旱相关基因的鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 抗旱相关基因全长cDNA克隆
• 5.3.2 无芒隐子草抗旱相关基因的鉴定
• 5.4 讨论
• 5.4.1 关于全长cDNA判别
• 5.4.2 荧光定量PCR的反应体积
• 5.4.3 关于外标准品的制备
• 5.4.4 关于内参基因的选择
• 5.4.5 常规RT-PCR、相对定量、绝对定量的比较
• 5.4.6 无芒隐子草CsALDH和CsLEA2基因
• 第六章 无芒隐子草CsALDH和CsLEA2基因转化拟南芥研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 应用Gateway克隆技术构建表达载体
• 6.2.3 电转化
• 6.2.4 拟南芥真空转化法
• 6.2.5 阳性植株的筛选
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 应用Gateway克隆技术构建表达载体
• 6.3.2 阳性植株的筛选
• 6.4 讨论
• 第七章 结论与展望
• 7.1 全文结论
• 7.2 创新点
• 7.3 进一步研究方向
• 参考文献
• 附录一 缩略词
• 附录二 实验所用的关键酶和试剂
• 附录三 溶液配方
• 附录四 实验中用到的启动子和终止子序列
• 附录五 载体
• 在读期间已发表或拟发表的学术论文:
• 致谢