海栖热袍菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆、表达及酶学性质

论文摘要

海栖热袍菌Thermotoga maritima是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的葡萄糖异构酶由于其出色的耐热性有着潜在的工业应用价值。由于T. maritima苛刻的培养条件导致其葡萄糖异构酶产量较低。通过PCR方法克隆T. maritima MSB8编码葡萄糖异构酶基因xylA至大肠杆菌Escherichia coli热激表达质粒pHsh,构建重组质粒pHsh-xylA1。通过mRNA二级结构在线分析软件MFOLD对重组质粒pHsh-xylA1中翻译起始位点AUG附近mRNA二级结构的空间构象与mRNA二级结构自由能进行分析,在不改变目的基因翻译的氨基酸序列的前提下,利用同义突变和改变AUG前某些碱基序列的方法,达到打破mRNA的核糖体结合位点及翻译起始位点的茎环结构,提高mRNA自由能的目的,构建优化后表达质粒pHsh-xylA2。电击转化E. coli JM109,诱导表达,分析酶活,E. coli JM109（pHsh-xylA2）酶活为3.6 U/mL发酵液,比酶活为4.95 U/mg粗蛋白,是优化前的3.8倍。通过热处理和离子交换层析纯化两步得到电泳纯的酶制品,纯化倍数和回收率分别为8.02和49.02。对酶学性质研究表明,该重组酶为金属离子激活性酶,Mg2+,Co2+对相对酶活有很强的激活作用,其最适pH为7.0,最适反应温度为95℃,且在pH68之间有着较好的稳定性,在95℃下半衰期长达5 h以上。以葡萄糖为底物时的表观Km和Vmax分别为105 mmol/L和45.2 U/mg。通过在摇瓶条件的优化,得到经济适用、适合重组菌E. coli JM109（pHsh-xylA2）发酵的合成培养基配方:葡萄糖10 g/L,（NH4）2SO4 6 g/L,蛋白胨2 g/L,KH2PO4 10 g/L,MgSO4·7H2O 3 g/L,柠檬酸3 g/L,TES 1 mL/L,pH 7.0。在3.7 L台式发酵罐中,在控制溶氧30%以上,在重组菌的对数生长中期开始流加碳氮源,在对数生长后期升温诱导8 h,最终菌体光密度达到44.8,重组菌发酵液酶活为15.6 U/mL,比酶活为4.23 U/mg粗蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 葡萄糖异构酶简介
• 1.1.2 高果糖浆研究现状与葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用
• 1.1.3 嗜热菌和耐热性葡萄糖异构酶的研究现状
• 1.1.4 影响外源基因在大肠杆菌宿主中表达因素的研究进展
• 1.2 立题背景及意义
• 1.3 课题研究内容
• 第二章 葡萄糖异构酶编码基因xylA 的克隆、序列优化与表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 T. maritima 的培养方法
• 2.2.6 T. maritima 基因组DNA 的提取方法
• 2.2.7 电转化感受态细胞的制备
• 2.2.8 引物设计及目的基因PCR 方法扩增
• 2.2.9 pHsh-xylA1 的构建、转化及阳性转化子的筛选
• 2.2.10 经过序列优化的表达载体pHsh-xylA2 的构建
• 2.2.11 粗酶液的制备及重组酶酶活的测定
• 2.2.12 重组酶蛋白的SDS-PAGE 检测
• 2.2.13 菌株质粒稳定性实验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 xylA 基因的克隆与pHsh-xylA1 的构建
• 2.3.2 mRNA 二级结构的优化以及pHsh-xylA2 的构建
• 2.3.3 重组菌株E. coli JM109（pHsh-xylA2）诱导条件的优化
• 2.3.4 突变效果的对比
• 2.3.5 重组质粒pHsh-xylA2 的稳定性
• 2.4 本章小结
• 第三章 重组耐热葡萄糖异构酶的纯化与性质
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种与培养基
• 3.2.2 主要试剂及缓冲液
• 3.2.3 主要仪器及其生产厂商
• 3.2.4 重组葡萄糖异构酶的纯化
• 3.2.5 重组葡萄糖异构酶的酶学性质的测定
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 葡萄糖异构酶的纯化
• 3.3.2 重组葡萄糖异构酶的性质
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组菌E. coli JM109（pHsh-xylA2）表达培养
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 试剂
• 4.2.4 主要仪器及其生产厂商
• 4.2.5 种子培养
• 4.2.6 培养基优化
• 4.2.7 发酵罐培养方法
• 4.2.8 葡萄糖浓度的测定
• 4.2.9 菌体浓度和重量
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 培养基组分对重组菌生长的影响
• 4.3.2 3.8 L 台式发酵罐中重组菌的培养
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文