B组轮状病毒核酸杂交检测方法的建立及其初步应用

论文摘要

人B组轮状病毒（group B rotavirus，GBRV）由我国洪涛1983年首次发现，主要感染成年人，在我国多次引起大规模的暴发性腹泻的大流行。人群B组轮状病毒抗体水平调查结果显示，其他国家和地区人群中都检测到滴度不同的B组轮状病毒抗体。除了中国之外，在周边国家印度、孟加拉等国也相继从散发的霍乱样腹泻病例中检测到B组轮状病毒。本研究旨在建立一种方便、快捷、灵敏高、特异性强的检测技术和方法，用于B组轮状病毒的检测，有助于深入研究B组轮状病毒的生物学特征、流行病学规律、检测技术以及防治措施等。用PCR法对B组轮状病毒nsp5基因作同位素标记，测试探针的灵敏度和特异性，并用于检测腹泻样本。结果显示探针灵敏度达500pg，特异性好，不与无关的基因产生杂交信号。检测来源于武汉市的94例腹泻标本，其中阳性一例，用RT-PCR和序列测定的方法对该检测结果进行了验证。根据B组轮状病毒ADRV的vp7基因序列设计合成引物，在上、下游引物5’端标记生物素，用PCR法制备GBRV vp7基因片段的生物素标记探针，灵敏度达50ng，用同样的方法制备了地高辛标记探针，灵敏度达10ng，特异性好。本研究所采用的核酸杂交方法可用作B组轮状病毒的初筛，也可用来验证其它方法的检测结果，或是用于B组轮状病毒的流行病学研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 B组轮状病毒的病毒学特点
• 1.1 形态结构
• 1.2 B组轮状病毒的理化性质
• 1.3 B组轮状病毒的基因组及其编码蛋白质
• 1.4 RNA在 PAGE上迁移特征
• 1.5 B组轮状病毒的分离培养
• 2 人B组轮状病毒的流行病学
• 3 检测方法
• 3.1 电镜法（electronic microscope，EM）
• 3.2 免疫学检测技术
• 3.3 基因检测技术
• 3.4 病毒分离
• 4 研究目的与意义
• 第二章 同位素标记nsp5基因探针及其杂交检测
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2 实验结果
• 2.1 探针灵敏度试验
• 2.2 探针的特异性试验
• 2.3 杂交温度对探针灵敏度的影响
• 2.4 探针检测腹泻样本
• 2.5 阳性样的RT-PCR认证
• 2.6 nsp5基因克隆质粒的限制性内切酶分析
• 2.7 含nsp5基因的克隆质粒的PCR分析
• 2.8 阳性样nsp5基因序列测序结果如下
• 3 讨论
• 第三章 生物素标记vp7基因探针及其杂交检测
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2 实验结果
• 2.1 生物素标记vp7基因探针的电泳检测
• 2.2 探针标记效率
• 2.3 探针灵敏度
• 3 讨论
• 第四章 地高辛标记vp7基因探针及其杂交检测
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2 实验结果
• 2.1 探针灵敏度测定
• 2.2 探针特异性测定
• 2.3 探针检测腹泻样本
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 在校期间发表的论文、科研成果等
• 致谢