腺病毒介导CREG基因转染在兔颈动脉损伤后新生内膜形成中的作用

论文摘要

研究背景和目的:经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后再狭窄（RS）与PCI发展相伴相随,是当今心血管病界的重要课题。大量研究表明,血管平滑肌细胞通过一系列分子机制发生表型转换,丢失其分化标志物,并获得增殖、迁移的能力,是新生内膜形成及RS发生的病理基础。近年来,大量抗增殖药物,如雷帕霉素、紫杉醇等,广泛用于临床再狭窄的预防,在一定程度上降低了RS的发生。但是,这类药物都不可避免地抑制了内皮细胞的修复,从而引发了很多新的问题,如迟发性血栓形成,延迟内皮化等。因此,有必要寻找新的药物以选择性地抑制平滑肌细胞增殖,而不影响内皮化。E1A激活基因阻遏子（CREG）是新近发现的一个细胞转录调控基因,它由220个氨基酸残基构成,有3个糖基化位点。CRERG在单核细胞、造血祖细胞和VSMC等多种细胞中广泛表达并促进细胞成熟分化,抑制细胞增殖。本实验室前期研究表明,在体外培养的平滑肌细胞从合成表型向收缩表型转化的过程中,CREG表达上调,而CREG过表达也可以促进平滑肌细胞从合成表型向收缩表型转化,因此,CREG有可能成为抑制PCI术后再狭窄的有效药物。本研究以兔颈动脉球囊损伤模型为研究对象,应用腺病毒载体介导CREG基因在损伤血管中大量表达并观察CREG表达对VSMC表型转换的调控及对损伤血管内膜增生的影响,以期深入探讨CREG基因在PCI术后再狭窄发生中的作用。材料和方法:以KpnI和XhoI酶切位点将CREG cDNA全长亚克隆至pShuttle-CMV穿梭质粒中,以菌内同源重组的方法构建腺病毒重组子,在293细胞中包装产生CREG重组腺病毒。以CREG重组腺病毒及GFP对照腺病毒感染人VSMC细胞,应用免疫荧光染色、Western blot方法检测CREG和平滑肌分化标志蛋白SMα- actin、SM MHC表达,检测细胞增殖指标BrdU阳性细胞比例,以探讨CREG对VSMC分化的影响。应用雄性日本大耳白兔60只,建立颈动脉球囊拉伤模型,随机分为3组,分别将含有Ad-CREG、Ad-GFP的病毒液或PBS 1ml,注入损伤动脉段内孵育30min。各组动物于术后3d、7d、14d和28d行双侧颈总动脉造影,观察靶血管血流情况。术后经静脉注射50mg溴脱氧尿嘧啶,3小时后处死,取出损伤动脉及对侧未损伤的动脉。HE染色观察不同时间点血管SMC的移行、增殖及内膜、中膜增厚情况。免疫组化及Western blot分析CREG及平滑肌细胞标志物SMα-actin、SM MHC的表达。研究结果:成功构建重组腺病毒载体Ad-CREG;体外研究发现,腺病毒能够高效感染人VSMC细胞,使外源性基因在被目的细胞内高效表达。CREG转染能促进VSMC分化,抑制VSMC增殖。体内研究发现,在兔颈动脉球囊损伤修复过程中CREG表达与平滑肌细胞分化状态相关,免疫组织化学和Western blot结果显示,CREG在正常VSMC中高度表达,在球囊损伤后3d,血管中CREG显著下降,到第7 d表达开始恢复,在此后的14 d,28 d一直保持高表达状态。VSMC分化标记物SMα-actin和MHC在球囊损伤兔颈动脉中的表达趋势与CREG相似,免疫组织化学结果显示SMα-actin和MHC在正常的VSMC中高度表达,而在球囊损伤后3d和7d表达显著降低,球囊损伤后14 d后表达逐渐恢复到正常水平。而细胞增殖指标BrdU染色则表现出相反的趋势,在正常动脉中BrdU阳性细胞很少,在损伤后3d和7d BrdU阳性细胞大量出现,至14d再次降低到接近未损伤水平。形态学分析结果显示,兔颈动脉球囊损伤后有明显的新生内膜形成,Ad-CREG转染显著减少新生内膜形成,与对照组和Ad-GFP组相比,Ad-CREG组的内膜面积在动脉球囊损伤后28 d降低了约50%,而I/M分别也降低了50%以上。双侧颈动脉造影显示,Ad-CREG组术后28d的最小管腔内径明显高于盐水对照组和Ad-GFP组,而管腔狭窄率低于盐水对照组和Ad-GFP组。以上数据都说明,CREG转染可明显抑制颈动脉损伤后的新生内膜增生,防止再狭窄发生。免疫组织化学染色显示,对照组和Ad-GFP组在损伤后3d和7d可见大量BrdU阳性细胞,而Ad-CREG组BrdU阳性细胞明显减少。与BrdU染色结果相反,在血管损伤后7d,Ad-CREG治疗组血管SMα-actin,MHC表达水平显著高于生理盐水对照组和Ad-GFP组。这些结果表明,在动脉损伤修复的过程中,CREG能够促使平滑肌细胞保持在稳定的分化状态。免疫组织化学CD31染色表明,球囊损伤后14d,损伤动脉新生内膜表面内皮细胞覆盖不完全,Ad-CREG组与对照组和Ad-GFP组相比,内皮细胞覆盖率各组间无显著性差异;球囊损伤后28d,CD31染色显示各组动脉内皮覆盖完全,各组间无差别。以上结果表明,CREG转染在抑制VSMC增殖的同时并不抑制内皮细胞的增殖。结论:在血管急性损伤后进行CREG转染,能够抑制细胞增殖,促进细胞分化,从而抑制新生内膜的形成。CREG转染对于PCI术后再狭窄的预防有重要的研究价值。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 一、 支架内再狭窄的发生机制和影响因素
• 二、 支架内再狭窄的防治措施
• 三、 支架内再狭窄的基因治疗进展
• 四、 常用转基因方法概述
• （一） 载体系统
• （二） 递送系统
• 正文
• 实验一 重组人CREG腺病毒载体的构建
• 一、 材料
• 二、 方法
• 三、 结果
• 四、 讨论
• 实验二 腺病毒介导CREG基因转染促进体外培养的人VSMC分化
• 一、 材料
• 二、 方法
• 三、 结果
• 四、 讨论
• 实验三 腺病毒介导CREG基因转染抑制兔颈动脉球囊损伤后新生内膜形成
• 一、 材料
• 二、 方法
• 三、 结果
• 四、 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢