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猪2型圆环病毒核酸疫苗及重组伪狂犬病毒二价基因工程疫苗的研究

2020-11-23阅读(534)

猪2型圆环病毒核酸疫苗及重组伪狂犬病毒二价基因工程疫苗的研究

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），而且也与猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、猪先天性震擅、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从19世纪90年代发现可致猪的疾病以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群的感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大暴发，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50％，给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此用现代基因工程手段构建的第二代新型疫苗，必然在该病毒的防制上具有重要作用。本研究以编码PCV2核衣壳蛋白的ORF2基因为研究对象，实现了ORF2基因在真核细胞中的表达，并进一步将ORF2基因插入核酸疫苗载体构建了ORF2基因的核酸疫苗和“自杀性”DNA疫苗；同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因与ORF2基因在核酸疫苗和“自杀性”DNA疫苗中融合表达，通过蛋白转导增强疫苗的免疫效应；以伪狂犬病毒弱毒株TK/gE/LacZ+为亲本毒，构建了表达ORF2基因的重组伪狂犬病毒TK儋E/ORF2+；同时对构建的PCV2疫苗进行了动物试验，以探索一种可用于PCV2防制的新型疫苗。1．PCV2 ORF2及BHV-1 VP22基因在真核细胞中的表达及定位研究通过PCR方法扩增PCV2 ORF2基因和BHV-1 VP22基因，将扩增的基因连入T载体克隆测序后，用HindⅢ和BglⅡ双酶切将ORF2基因切下，连入pEGFP-N1载体的HindⅢ肌和BamHⅠ双酶切位点，得到ORF2基因的真核表达质粒pNORF2。用BamHⅠ和BglⅡ将BVP22基因从T载体上切下，连入pEGFP-NI载体的BamHⅠ位点，得到BVP22基因的真核表达质粒pNBVP22。通过脂质体转染的方法，将pEGFP-N1、pNORF2和pNBVP22质粒分别转染到Hela细胞中，转染18 h后在倒置荧光显微镜下观察荧光，可见转染pNORF2的Hela细胞有绿色荧光表达，且明显分布于核周，转染pNBVP22的细胞也有荧光表达，荧光主要分布于核周，而在细胞质中也发现有大量的荧光，转染pEGFP-N1的细胞则在整个细胞都可见散在荧光。以上结果说明了我们克隆的ORF2基因、BVP22基因在真核细胞中成功表达，为基因工程疫苗的研究奠定了基础。2．PCV2核酸疫苗的构建、免疫效应研究，以及BVP22基因免疫增强效应研究PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因，将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1（+），构建了PCV2的核酸疫苗pCORF2，同时分别将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，构建pCORF2BVP22、pCBVP22ORF2质粒。将上述质粒以及空载体pCDNA3.1肌肉免疫BALB/c小白鼠，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，用ELISA法检测体液抗体。实验结果显示，通过两次免疫后，加入蛋白转导的核酸疫苗组产生了PCV2特异性抗体，而单独用ORF2基因构建的核酸疫苗的免疫原性比较弱，证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好，可作为PCV2防制的一种候选疫苗3．PCV2“自杀性”DNA疫苗的构建、免疫效应研究，以及BVP22在“自杀性”DNA疫苗中的免增强效应研究将PCV2 ORF2基因克隆到“自杀性”DNA疫苗载体pSCA1和pSHAME2a，构建了ORF2的“自杀性”DNA疫苗pSORF2和pMORF2。进一步将BVP22基因插入ORF2基因的上游，构建了pSBVP22ORF2、pMBVP22ORF2“自杀性”DNA疫苗载体。肌肉注射免疫BALB/c小白鼠，首免后2周加强免疫一次，分别于首免后2周和6周采血，用ELISA方法检测血清体液抗体水平。从ELISA检测结果可以看出，一次免疫后2周即可刺激小白鼠产生针对PCV2的特异性体液抗体，而BVP22蛋白转导的效果在“自杀性”DNA疫苗中的效果并不明显。4．表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬疫苗毒株的构建将ORF2基因插入伪狂犬病毒重组转移载体plECMV，构建ORF2基因的重组转移质粒pIEORF2。用EcoRⅠ酶切伪狂犬病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组，与重组转移质粒pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞，经空斑纯化和PCR筛选，获得了新的重组病毒Tk-/gETORF2+。Southern blotting杂交结果显示，ORF2基因插入了PRV基因组预期的位置，用间接免疫荧光法和Western blotting杂交方法证明了插入的基因可在该重组病毒中进行表达。同时该病毒在IBRS-2细胞上连续传代15代后遗传稳定。该重组病毒在各种细胞上增殖滴度高，在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1TCID50/0.1mL，在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8TCID50/0.1mL，在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8TCID50/0.1mL。5．PCV2-PRV重组二价基因工程疫苗的免疫效应研究用上述构建的伪狂犬重组病毒疫苗株Tk-／gE-／ORF2+免疫28日龄左右断奶仔猪5头，作为对照同时用伪狂犬基因缺失病毒疫苗株Tk-／gE-／gI-免疫28日龄断奶仔猪5头，空白对照3头注射2 mL DMEM。首免后3周加强免疫一次，在首免后0，21，35，49天采血，用ELISA和中和试验的方法检测血清中的PRV和PCV2抗体，在第49天检测PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。试验结果显示，用Tk-/gE-／ORF2+、Tk-／gE-／gI-免疫猪在免疫后21天即可检测到抗伪狂犬病毒的中和抗体和ELISA抗体，在加强免疫后抗体滴度继续升高。ORF2 ELSIA检测的结果显示在Tk-／gE-／ORF2+免疫后21天，有的仔猪体内已有PCV2抗体产生，但是滴度都不高，在加强免疫后可见所有免疫仔猪发生PCV2的血清阳转。淋巴细胞增殖试验结果证实，Tk-／gE-／ORF2+可激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语表（Abbreviation）
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 猪圆环病毒研究进展
  • 1.1.1 猪圆环病毒及其分子生物学
  • 1.1.1.1 猪圆环病毒的发现
  • 1.1.1.2 PCV的分类地位
  • 1.1.1.3 PCV病原特征
  • 1.1.1.4 PCV的分子生物学特征
  • 1.1.1.5 ORF1基因研究
  • 1.1.1.6 ORF2基因研究
  • 1.1.1.7 ORF3基因研究
  • 1.1.1.8 PCV复制机制的研究
  • 1.1.2 猪圆环病毒的流行病学
  • 1.1.2.1 PCV的宿主
  • 1.1.2.2 PCV的传播途径
  • 1.1.2.3 PCV流行传播的特点
  • 1.1.2.4 PCV的分子流行病学研究
  • 1.1.3 临床症状与病理变化
  • 1.1.3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征
  • 1.1.3.2 猪皮炎与肾病综合征
  • 1.1.3.3 母猪繁殖障碍
  • 1.1.3.4 猪呼吸道疾病综合征
  • 1.1.3.5 增生性坏死性肺炎
  • 1.1.3.6 先天性震颤
  • 1.1.4 动物模型
  • 1.1.4.1 PCV2单独感染动物模型的建立
  • 1.1.4.2 PCV2与其他病原混合感染动物模型的建立
  • 1.1.4.3 PCV2感染小动物模型的建立
  • 1.1.5 PCV2与免疫系统关系研究
  • 1.1.5.1 PCV2对免疫细胞的影响
  • 1.1.5.2 PCV2感染对细胞因子的影响
  • 1.1.5.3 免疫刺激对PCV2的感染的影响
  • 1.1.5.3.1 疫苗免疫在预防PCV2感染中的作用
  • 1.1.5.3.2 免疫刺激增强PCV2的感染
  • 1.1.6 圆环病毒诊断方法研究
  • 1.1.6.1 原位杂交法
  • 1.1.6.2 免疫组织化学法
  • 1.1.6.3 聚合酶链反应法
  • 1.1.6.4 酶联免疫吸附试验
  • 1.1.6.5 间接免疫荧光法及免疫过氧化物酶单层试验
  • 1.1.6.6 病毒分离
  • 1.1.7 PCV2疫苗研究
  • 1.1.8 PCV2的公共卫生意义
  • 1.2 核酸疫苗研究进展
  • 1.3 "自杀性"DNA疫苗的研究进展
  • 1.4 蛋白转导的研究进展
  • 1.5 伪狂犬病毒活疫苗载体的研究进展
  • 第二章 目的与意义
  • 第三章 PCV2 ORF2及BHV-1 VP22基因在真核细胞中的表达及定位研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 试验材料
  • 3.1.1.1 细胞系、菌株和毒株
  • 3.1.1.2 质粒、载体
  • 3.1.1.3 引物
  • 3.1.1.4 酶及生化试剂
  • 3.1.1.5 培养基
  • 3.1.1.6 质粒提取用缓冲液
  • 3.1.2 实验方法
  • 3.1.2.1 ORF2基因的PCR扩增
  • 3.1.2.2 BVP22基因的PCR扩增
  • 3.1.2.3 PCR产物的回收
  • 3.1.2.4 PCR产物与T载体的连接
  • 3.1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
  • 3.1.2.6 连接产物的转化
  • 3.1.2.7 质粒的小量提取与鉴定
  • 3.1.2.8 真核表达质粒pNORF2、pNBVP22的构建
  • 3.1.2.9 真核表达质粒的大量制备
  • 3.1.2.10 真核质粒的转染
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 ORF2和BVP22基因的PCR扩增
  • 3.2.2 pTORF2和pTBVP22的鉴定
  • 3.2.3 真核表达质粒pNORF2、pNBVP22的鉴定
  • 3.2.4 ORF2、BVP22基因在Hela细胞中的表达
  • 第四章 PCV2核酸疫苗的构建及免疫效应研究
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 试验材料
  • 4.1.1.1 质粒和菌株
  • 4.1.1.2 酶及生化试剂
  • 4.1.1.3 PCR引物
  • 4.1.1.4 ELISA缓冲液
  • 4.1.1.5 试验动物
  • 4.1.2 试验方法
  • 4.1.2.1 ORF2及BVP22基因的PCR扩增
  • 4.1.2.2 质粒pCORF2的构建
  • 4.1.2.3 质粒pCORF2BVP22的构建
  • 4.1.2.4 质粒pCBVP22ORF2的构建
  • 4.1.2.5 质粒pSORF2的构建
  • 4.1.2.6 质粒pMORF2的构建
  • 4.1.2.7 质粒pSBO的构建
  • 4.1.2.8 质粒pMBO的构建
  • 4.1.2.9 核酸疫苗的大量制备
  • 4.1.2.10 试验动物免疫
  • 4.1.2.11 ORF2抗原的表达与纯化
  • 4.1.2.12 ELISA方法检测体液抗体
  • 4.1.2.13 统计学方法
  • 4.2 结果与分析
  • 4.2.1 ORF2与BVP22基因PCR扩增
  • 4.2.2 pCORF2、pCORF2BVP22、pCBVP22ORF2的鉴定
  • 4.2.3 pSORF2、pMORF2、pSBO、pMBO的鉴定
  • 4.2.4 ELISA方法检测体液抗体
  • 第五章 表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬疫苗毒株的构建及免疫效应研究
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 试验材料
  • 5.1.1.1 细胞和毒株
  • 5.1.1.2 菌株和质粒
  • 5.1.1.3 引物
  • 5.1.1.4 主要试剂与试剂盒
  • 5.1.1.5 缓冲液
  • 5.1.1.5.1 SDS PAGE缓冲液
  • 5.1.1.5.2 Western blotting缓冲液
  • 5.1.1.5.3 ELISA缓冲液
  • 5.1.1.5.4 Southern blotting用缓冲液
  • 5.1.1.5.5 其它缓冲液
  • 5.1.1.6 实验动物
  • 5.1.2 方法
  • 5.1.2.1 ORF2基因的扩增
  • 5.1.2.2 重组转移质粒pIEORF2的构建
  • 5.1.2.3 伪狂犬病毒的传代
  • 5.1.2.4 伪狂犬病毒基因组的提取
  • 5.1.2.5 重组病毒的构建
  • 5.1.2.6 空斑法纯化病毒
  • 5.1.2.7 Southern blotting鉴定重组病毒
  • 5.1.2.7.1 探针的制备
  • 5.1.2.7.2 转印
  • 5.1.2.7.3 转印膜的干燥与固定
  • 5.1.2.7.4 预杂交和杂交
  • 5.1.2.7.5 洗膜
  • 5.1.2.7.6 免疫检测
  • 5.1.2.8 ORF2在重组病毒中表达检测
  • 5.1.2.8.1 Western blotting检测ORF2基因的表达
  • 5.1.2.8.2 间接免疫荧光法检测ORF2基因的表达
  • 5.1.2.9 病毒的冻干
  • 5.1.2.10 重组病毒在各种细胞上毒价的测定及疫苗制备
  • 5.1.2.11 二价基因工程疫苗动物试验
  • 5.1.2.12 微量中和试验法检测中和抗体
  • 5.1.2.14 ELISA方法检测体液抗体
  • 5.1.2.15 淋巴细胞增殖效应试验
  • 5.1.2.15.1 外周血单核细胞的分离
  • 5.1.2.15.2 淋巴细胞增殖反应试验
  • 5.1.2.16 统计学方法
  • 5.2 结果与分析
  • 5.2.1 ORF2基因的PCR结果
  • 5.2.2 pIEORF2重组转移质粒的构建
  • 5.2.3 重组病毒的空斑筛选
  • 5.2.4 重组病毒在细胞上增殖滴度的测定
  • 5.2.5 重组病毒的Southern blotting鉴定
  • 5.2.6 重组病毒表达ORF2基因的Western blotting鉴定
  • 5.2.7 重组病毒表达ORF2基因的间接免疫荧光鉴定
  • 5.2.8 遗传稳定性评价
  • 5.2.9 重组病毒免疫猪的体液免疫反应测定
  • 5.2.9.1 伪狂犬病毒ELISA抗体测定
  • 5.2.9.2 伪狂犬病毒中和抗体测定
  • 5.2.9.3 PCV2 ELISA抗体检测
  • 5.2.9.4 PRV gE抗体ELISA检测
  • 5.2.10 重组病毒免疫猪的细胞免疫效应研究
  • 第六章 讨论
  • 6.1 PCV2与猪圆环病毒病
  • 6.2 BVP22基因的PCR扩增
  • 6.3 兔抗ORF2高免血清的制备
  • 6.4 ORF2、BVP22基因的真核表达以及表达后的定位
  • 6.5 核酸疫苗的免疫效果
  • 6.6 BVP22蛋白转导的免疫增强效应
  • 6.7 "自杀性"DNA疫苗以及BVP22蛋白转导在"自杀性"DNA疫苗中的作用
  • 6.8 疫苗在防制PCV2感染中的作用
  • 6.9 伪狂犬病毒作为PCV2疫苗载体的优越性
  • 6.10 PCV2-PRV重组病毒的构建
  • 6.11 外源基因在伪狂犬病毒中的表达
  • 6.12 PCV2-PRV重组二价基因工程疫苗的免疫效果
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

    • 相关论文文献

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