猪Rspo3基因的原核及真核表达研究

论文摘要

Rspo基因家族是新近发现的一个基因家族,包括4个家族成员,通过与胞膜蛋白FZD和LRP5/6相互作用而激活Wnt/β-catenin （β连环蛋白）信号途径,对细胞增殖分化、个体发育以及肿瘤的生长转移等进行调控。Rspo基因家族分布广泛,在不同物种中具有很高的保守性。Rspo基因尤其是Rspo3基因,通过基因敲除手段研究其功能的时候,敲除了Rspo3基因的小鼠不能正常发育成活体,揭示了Rspo3基因在动物个体发育中起着极为关键的作用,但同时为进一步研究基因功能带来很大的障碍。通过对猪Rspo3基因的研究,对猪的新品种选育、疾病防治等都有重大的意义。本试验利用PCR的方法,克隆得到了猪Rspo3基因,检测了该基因的组织表达分布,并利用pET28a作为载体成功在大肠杆菌BL21中得到表达。为了进一步在真核细胞内研究Rspo3基因功能,构建了不同启动子组合的真核表达载体,并对不同载体的表达效率进行了筛选。1.利用电子克隆技术,设计了猪Rspo3基因的扩增引物,以猪的肝脏提取的总RNA为模板,利用RT-PCR成功获取了猪的Rspo3基因,经过测序确认,猪Rspo3的开放阅读框有828bp,编码275个氨基酸,其中包含56个酸性氨基酸和62个碱性氨基酸,蛋白质分子量为31.32KDa,等电点为：9.94,并对猪Rspo3的三维结构进行了预测,蛋白分子三维尺寸为： X：44.486Y：45.211z：47.410（单位：10-10米）,属于球状蛋白质。Rspo3基因在猪各个组织表达分布检测表明Rspo3基因除了在脾和脂肪组织中几乎很少表达外,其它常见组织中均有表达,其中在脑和睾丸表达丰度最高；2.将猪Rspo3基因整合到pET28a原核表达载体上,在Rspo3基因前添加了6×His-Tag,便于后期检测和纯化,利用大肠杆菌BL21作为宿主菌,优化后的猪Rspo3基因在大肠杆菌BL21中的表达条件为：温度26℃时,0.5mg/ml的1PTG浓度,诱导时间为2h。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot检测,确认成功表达了融合蛋白,分子量为35.19kDa；3.用酶切连接技术将Rspo3基因与10个不同启动子组合的真核表达载体（P1-P10）进行连接时,Rspo3自身所带的NcoI酶切位点成为正常的酶切连接反应的障碍。利用重叠延伸PCR的方法,先对猪Rspo3基因自身携带的NcoI酶切位点进行了同义突变,测序结果证实了突变获得了成功,除了突变位点,其它序列保持了不变,编码的氨基酸序列没有改变。利用亚克隆的方法,将突变后的Rspo3基因从T载体上NcoI和Nhe1双酶切后与P1-P10相连,经PCR、酶切和测序均验证正确,成功的构建了携带Rspo3基因的10个不同启动子组合的真核表达载体；4.在PK15细胞上的转染试验结果表明,GFP蛋白表达的效率最高的P5质粒,相对于对照组转染peGFP-N1质粒提高了458.9%,到第14天还能观测到GFP荧光,P6质粒的GFP表达效率仅次于P5质粒。用Q-PCR检测Rspo3效率P5质粒和P6质粒显著高于其它组,考虑到误差因素和检测目的分子的差异,最合适PK15细胞平台的启动子组合是P5质粒所携带的CMV（Human）+HTLV RU5’（Viral）+CMV（Human）；5.对鸡成纤维细胞DF1、犬肾细胞MDCK和人源的Hela细胞,也进行了不同启动子组合的筛选,对不同细胞转染结果通过荧光显微镜检测、GFP荧光吸光值测定和表达持续时间测定,在DF1细胞和MDCK细胞中表达效率最高的是P6质粒,启动子组合为启动子组合为CMV（Human）+HTLV RU5’（Viral）+Sv40（Viral）.而在Hela细胞上表达效率最高的是P5质粒,启动子组合为CMV（Human）+HTLV RU5’（Viral）+CMV（Human）。综上所述,本试验成功的克隆得到猪Rspo3基因,首次对该基因的不同组织表达分布进行了检测,在大肠杆菌BL21也成功获得了蛋白表达。构建了携带Rspo3基因不同启动子组合的真核表达载体,并对不同启动子组合的质粒在4种不同的细胞系上表达效率筛选,为进一步研究Rspo3的基因功能,促进其在理论研究及畜牧业中实际应用奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 目录
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 综述一 Rspo基因研究进展
• 综述二 影响质粒载体表达效率DNA序列研究进展
• 第二章 猪Rspo3基因的克隆与组织分布
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 菌株和质粒
• 2.3 主要仪器
• 2.4 主要试剂
• 3 方法
• 3.1 猪Rspo3基因的RT-PCR扩增
• 3.1.1 猪Rspo3基因引物设计与克隆
• 3.1.2 猪各个组织总RNA的提取
• 3.1.3 反转录
• 3.1.4 PCR扩增
• 3.1.5 PCR产物切胶纯化
• 3.1.6 连接T载体
• 3.2 DNA序列分析
• 3.3 猪Rspo3基因的组织分布
• 4 结果与分析
• 4.1 猪Rspo3基因的RT-PCR扩增
• 4.2 猪Rspo3克隆序列分析
• 4.3 猪Rspo3基因的组织分布
• 5 讨论
• 6 小结
• 第三章 猪Rspo3基因的原核表达
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 菌株和质粒
• 2.3 主要仪器
• 2.4 主要试剂
• 3 方法
• 3.1 猪pET-28a（+）-Rspo3原核表达载体的构建与鉴定
• 3.1.1 表达载体的提取纯化与pET-28a（+）-Rspo3重组表达载体的构建
• 3.1.2 重组质粒的转化和筛选
• 3.1.3 重组质粒的菌液PCR鉴定
• 3.1.4 重组质粒的酶切鉴定
• 3.1.5 重组表达质粒的序列测定
• 3.2 猪Rspo3基因的原核表达
• 3.2.1 表达载体转化进宿主细胞BL21及鉴定
• 3.2.2 表达条件的筛选
• 3.3 猪Rspo3蛋白的Western blot鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 猪pET-28a（+）-Rspo3原核表达载体的构建与鉴定
• 4.1.1 重组表达载体的构建
• 4.1.2 重组表达载体的鉴定
• 4.1.2.1 重组质粒的菌落PCR鉴定
• 4.1.2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 4.1.2.3 重组质粒的测序鉴定结果
• 4.2 猪Rspo3基因的原核表达
• 4.2.1 表达载体转化宿主细胞BL21及鉴定
• 4.2.2 表达条件的筛选
• 4.3 Western blot鉴定
• 5 结论与讨论
• 6 小结
• 第四章 不同启动子的猪Rspo3基因的真核表达载体构建
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 菌株和质粒
• 2.3 主要仪器
• 2.4 主要试剂
• 3 方法
• 3.1 Rspo3基因的同义突变
• 3.2 Rspo3基因的同义突变的鉴定
• 3.3 Rspo3突变产物与T载体连接
• 3.4 10种真核表达载体（P1-P10）的提取纯化与重组表达载体的构建
• 3.5 重组质粒的转化筛选与PCR鉴定
• 3.6 重组质粒的Nco I/Nhe I双酶切鉴定与序列测定
• 4 结果与分析
• 4.1 Rspo3基因的同义突变
• 4.2 Rspo3基因的同义突变的鉴定
• 4.3 Rspo3突变产物与T载体连接
• 4.4 10种真核表达载体（P1-P10）的提取纯化与重组表达载体的构建
• 4.5 重组质粒的转化筛选与PCR鉴定
• 4.6 重组质粒的NcoI/NheI双酶切鉴定与序列测定
• 5 讨论
• 6 小结
• 第五章 不同启动子组合真核表达载体在不同细胞系表达效率筛选
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 质粒和细胞
• 2.3 主要仪器
• 2.4 主要试剂
• 3 方法
• 3.1 真核表达载体在PK15细胞表达研究
• 3.1.1 真核表达载体（P1-P10）GFP表达荧光显微镜检测
• 3.1.2 真核表达载体（P1-P10）表达GFP荧光吸光值检测
• 3.1.3 真核表达载体（P1-P10）在PK15上GFP持续表达时间检测
• 3.1.4 Q-PCR检测携带Rspo3的真核表达载体在PK15中的表达
• 3.2 真核表达载体（P1-P10）在MDCK细胞GFP表达
• 3.2.1 真核表达载体（P1-P10）GFP表达荧光显微镜检测
• 3.2.2 真核表达载体（P1-P10）GFP表达GFP荧光吸光值检测
• 3.2.3 真核表达载体（P1-P10）在MDCK上GFP持续表达时间检测
• 3.3 真核表达载体（P1-P10）在Hela细胞GFP表达
• 3.3.1 真核表达载体（P1-P10）GFP表达荧光显微镜检测
• 3.3.2 真核表达载体（P1-P10）表达GFP荧光吸光值检测
• 3.3.3 真核表达载体（P1-P10）在Hela上GFP持续表达时间检测
• 3.4 真核表达载体（P1-P10）在DF1细胞GFP表达
• 3.4.1 真核表达载体（P1-P10）GFP表达荧光显微镜检测
• 3.4.2 真核表达载体（P1-P10）表达GFP荧光吸光值检测
• 3.4.3 真核表达载体（P1-P10）在DF1上GFP持续表达时间检测
• 4 结果与分析
• 4.1 真核表达载体在PK15细胞表达研究
• 4.1.1 真核表达载体（P1-P10）GFP表达荧光显微镜检测
• 4.1.2 真核表达载体（P1-P10）表达GFP荧光吸光值检测
• 4.1.3 真核表达载体（P1-P10）GFP在PK15上表达时间检测
• 4.1.4 Q-PCR检测携带Rspo3的真核表达载体在PK15中的表达
• 4.2 真核表达载体（P1-P10）在MDCK细胞GFP表达
• 4.2.1 真核表达载体（P1-P10）GFP表达荧光显微镜检测
• 4.2.2 真核表达载体（P1-P10）GFP表达GFP荧光吸光值检测
• 4.2.3 真核表达载体（P1-P10）在MDCK上GFP持续表达时间检测
• 4.3 真核表达载体（P1-P10）在Hela细胞GFP表达
• 4.3.1 真核表达载体（P1-P10）GFP表达荧光显微镜检测
• 4.3.2 真核表达载体（P1-P10）表达GFP荧光吸光值检测
• 4.3.3 真核表达载体（P1-P10）在Hela上GFP持续表达时间检测
• 4.4 真核表达载体（P1-P10）在DF1细胞GFP表达
• 4.4.1 真核表达载体（P1-P10）GFP表达荧光显微镜检测
• 4.4.2 真核表达载体（P1-P10）表达GFP荧光吸光值检测
• 4.4.3 真核表达载体（P1-P10）在DF1上GFP持续表达时间检测
• 5 结论与讨论
• 5.1 PK15细胞上不同启动子组合的质粒表达
• 5.2 MDCK、Hela和DF1细胞上不同启动子组合的质粒表达
• 6 小结
• 本文创新点
• Abstract
• 参考文献
• 附录一：作者简介及发表的文章
• 附录二：缩略词表