红麻细胞质雄性不育相关基因nad的克隆与再生体系初探

论文摘要

红麻是我国重要的纤维作物之一,它的纤维品质良好且用途广泛,具有重要的应用价值,因此被视为21世纪极具发展潜力的多用途作物。和其他作物一样,利用细胞质雄性不育系培育红麻杂交品种成为目前红麻育种的主要研究方向。利用作物的细胞质雄性不育性（Cytoplasmic Male Sterility, CMS）是作物的杂种优势利用的主要途径,而CMS的机理又非常复杂,因此有关CMS的研究也成为国内外学者研究的热点和难点课题。大量的研究表明,细胞质雄性不育与线粒体DNA的变异有密切的联系。本课题组前期的工作通过SRAP分子标记技术证实线粒体nad基因片段在不育系和保持系中存在差异。为了更好的研究细胞质雄性不育与线粒体DNA之间的关系,本研究以红麻不育系P3A及相应保持系P3B为实验材料,建立了分离高质量红麻线粒体DNA的方法,重点克隆了可能与红麻细胞质雄性不育相关基因nadl、nad2和nad3；同时对基因nadl-9进行了半定量RT-PCR分析；对红麻再生体系建立进行了初步探索,主要结果如下：（1）采用红麻黄化苗为材料,结合密度梯度离心和差速离心的方法提取线粒体DNA（mtDNA）,结果显示蔗糖密度梯度离心法比Percoll密度梯度离心法更适合于红麻线粒体的分离。提取的mtDNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测,并设计叶绿体和核特异性基因引物检测是否有污染存在,结果显示此方法提取的mtDNA纯度高,没有污染。（2）根据NCBI数据库nad基因保守序列设计简并引物,利用PCR扩增在不育系和保持系中分别获得了nad1、nad2、nad3基因的保守序列,其长度为817bp、1052bp、235bp,把这些片段的基因序列与甜菜和毛竹、烟草、西瓜比对,其同源性分别达到98.2%、96.7%、97%,说明所扩增的片段为正确片段。并将同一基因序列在两系之间比较,发现只有个别碱基不同。其中nad1基因有2个碱基不同,分别为P3A中第115位由A→G、第411位由A→G,P3B在第247位缺失了一个A碱基,两系同源性达到99.6%。nad2基因在P3A中第189位缺失一个T碱基,第206位由G→A,第477位由A→G,第863位由A→G,第936位由C→T,同源性达到99.5%。而nad3基因只有一个碱基的差异,即第94位由G→A,同源性为99.6%。半定量RT-PCR分析得出,nad1、nad2、nad3、nad4、nad5基因表达量在两系之间没有明显差异。nad4L、nad6不育系的表达量相对保持系较高。nad7、nad9不育系的表达量相对保持系较低。（3）红麻再生体系建立初步研究得出,在培养条件为25±1℃,光照时间14 h/d,光照强度为21001x左右左右的条件下,以红麻胚为外植体材料,诱导愈伤较适宜的培养基配方为：处理A6：MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D,能诱导出能力强的愈伤组织,其量多、黄绿色、质地紧实,愈伤组织诱导发生频率高达100%。分化培养基以MS为基本培养基,添加0.5-2.5mg/mL的6-BA和0.1-0.5mag/mL的NAA,随着6-BA的浓度增加,NAA浓度较低的处理愈伤组织绿点较少,浓度较高时绿点增多,说明6-BA和NAA两种激素搭配可以诱导出分化的细胞,目前最适宜的分化培养基足处理B20:MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,但要诱导出不定芽其用量和配比还有待进一步试验。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物细胞质雄性不育的研究进展
• 1.1.1 植物细胞质雄性不育的遗传研究
• 1.1.2 植物细胞质雄性不育的生理生化研究
• 1.1.3 植物细胞质雄性不育的细胞学研究
• 1.1.4 植物细胞质雄性不育的分子研究
• 1.2 植物线粒体与CMS的研究进展
• 1.2.1 线粒体基因组与CMS的关系
• 1.2.2 线粒体嵌合基因与CMS的关系
• 1.2.3 mRNA编辑与CMS的关系
• 1.2.4 线粒体质粒与CMS的关系
• 1.3 红麻杂种优势利用和CMS的研究进展
• 1.4 课题研究意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 载体与菌株
• 2.1.3 引物设计
• 2.1.4 主要试剂及酶类
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 红麻高纯度线粒体DNA提取
• 2.2.2 线粒体基因nad1、nad2、nad3克隆
• 2.2.3 线粒体基因nadl-nad9 RT-PCR半定量分析
• 2.2.4 红麻再生体系建立的初步摸索
• 3 结果与分析
• 3.1 红麻高纯度线粒体DNA提取
• 3.1.1 Percoll和蔗糖两种密度梯度离心对比分析
• 3.1.2 Jannus Green B检测结果
• 3.1.3 紫外吸收光度分析
• 3.1.4 mtDNA的琼脂糖电泳检测结果
• 3.1.5 PCR检测mtDNA纯度
• 3.2 线粒体基因nad1、nad2、nad3克隆
• 3.2.1 红麻花药总RNA提取质量分析
• 3.2.2 nad1基因片段在不育系和保持系中的克隆分析
• 3.2.3 nad2基因片段在不育系和保持系中的克隆分析
• 3.2.4 nad3基因片段在不育系和保持系中的克隆分析
• 3.3 线粒体基因nad1-nad9半定量RT-PCR分析
• 3.3.1 模板使用量
• 3.3.2 循环数的优化
• 3.3.3 半定量产物检测与分析
• 3.4 红麻再生体系的建立
• 3.4.1 愈伤组织的诱导分析
• 3.4.2 不定芽分化的分析
• 4 讨论
• 4.1 红麻高纯度线粒体DNA提取
• 4.2 线粒体基因nad1、nad2、nad3克隆
• 4.3 线粒体基因nad1-nad9半定量RT-PCR分析
• 4.4 红麻再生体系的建立初步摸索
• 4.4.1 不同激素配比对红麻愈伤组织的诱导
• 4.4.2 不定芽的诱导
• 5 结论
• 5.1 红麻高纯度线粒体DNA提取
• 5.2 线粒体基因nad1、nad2、nad3克隆
• 5.3 线粒体基因nad1-nad9半定量RT-PCR分析
• 5.4 红麻再生体系的建立初步摸索
• 6 展望
• 致谢
• 参考文献
• 在读期间发表论文