论文题目: 红曲霉遗传转化系统及桔霉素、Monacolin K生物合成相关PKS基因的克隆与功能鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 周礼红
导师: 诸葛健
关键词: 红曲霉,遗传转化系统,基因,基因
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 红曲霉是重要的工业丝状真菌,蕴藏着丰富的聚酮体,是药物开发的宝库。为了探讨聚酮体合成途径和相关途径调控本文开展和完成了一下研究工作。 为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30—40h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为:0.3%lysing enzyme、0.1%cellulase和1%snailase的酶组合,30℃作用2.5h;最适渗透压稳定剂是:1mol/LMgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5%和36.4%。 为了研究红曲霉聚酮体途径,考察和比较了四种不同的转化方法以建立有效的红曲霉遗传转化系统。以潮霉素作为抗性筛选标记,pBC-Hygro作为转化载体,用基于原生质体的传统转化和电击转化、基于萌发孢子的电击转化以及REMI技术转化红曲霉。发现基于萌发孢子的电击转化由于转化率极低而不适于红曲霉转化。基于原生质体的传统转化和电击转化尽管每微克DNA分别能获得135个转化子和125个转化子,但因转化子稳定性差也适合红曲霉转化的转化。应用REMI技术,转化率提高约36倍,每微克DNA 4481个转化子,70%—75%的转化子的稳定,非常适合于红曲霉的转化。 分离、克隆了pksCT1和pksCT2基因,并完成了测序和序列分析。应用REMI技术介导敲除了红曲霉pksCT1基因,确证pksCT1是红曲霉桔霉素合成途径中一个关键聚酮体合成酶的编码基因。同时构建得到的无桔霉素红曲霉基因工程菌。 分离和克隆了红色红曲霉的monK1基因,并完成测序和序列分析。应用REMI技术介导敲除红曲霉MonK1基因,初步推定monK1是红曲霉九酮体合成酶编码基因。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 聚酮体合成酶
1.2 丝状真菌聚酮体合成酶的特征
1.2.1 丝状真菌PKSs的类型
1.2.2 丝状真菌PKSs的特征
1.3 已分离和克隆的真菌PKSs
1.3.1 己分离鉴定的真菌 PKSs
1.3.2 新的聚酮体合成酶基因的分离
1.4 真菌 PKSs在系统发育分析中的应用
1.5 丝状真菌PKSs途径工程
1.6 红曲霉
1.6.1 红曲霉的分类
1.6.2 红曲色素
1.6.3 红曲霉聚酮体研究
1.7 立题背景
1.8 研究内容和意义
参考文献
第二章 红曲霉原生质体的制备与再生
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.3 结果与分析
2.3.1 原生质体制备
2.3.2 原生质体再生
2.3.3 原生质体共转化
2.4 讨论
2.5 本章小结
参考文献
第三章 红曲霉不同转化方法比较
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.3 结果与分析
3.3.1 线性化载体与未线性化载体的转化率比较
3.3.2 基于原生质体的传统转化
3.3.3 基于原生质体的电击转化
3.3.4 基于萌发孢子的电击转化
3.3.5 REMI介导的转化
3.4 讨论
3.5 本章小结
参考文献
第四章 REMI介导的红曲霉遗传转化系统
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.3 结果与分析
4.3.1 不同限制性酶对红曲霉转化率的影响
4.3.2 酶切缓冲液对红曲霉转化的影响
4.3.3 原生质体浓度对红曲霉转化率的影响
4.3.4 限制性酶浓度对转化的影响
4.3.5 载体DNA用量对红曲霉转化率的影响
4.3.6 不同类型载体对红曲霉转化率的影响
4.4 讨论
4.5 本章小结
参考文献
第五章 红曲霉桔霉素编码基因的分离、克隆与功能鉴定
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.3 结果与分析
5.3.1 pksCT1的克隆和序列分析
5.3.2 pksCT2的克隆
5.3.3 敲除载体的构建
5.3.4 REMI技术介导菌株CICC5006桔霉素基因的敲除
5.3.5 潮霉素B抗性突变株稳定性检测
5.3.6 稳定突变株 PCR鉴定
5.3.7 REMI介导菌株43桔霉素基因的敲除
5.3.8 桔霉素检测
5.3.9 Monacolin K和色价的检测
5.3.10 菌落形态
5.4 讨论
5.5 本章小结
参考文献
第六章 Monacolin K编码基因的分离、克隆与功能鉴定
6.1 引言
6.2 材料与方法
6.3 结果与分析
6.3.1 monK1的克隆和序列分析
6.3.2 敲除载体pTmonK1Hyg的构建
6.3.3 REMI介导pTmonK1Hyg整合到红曲霉染色体DNA
6.3.4 潮霉素B抗性突变株稳定性检测
6.3.5 稳定突变株 PCR验证
6.3.6 发酵产物Monacolin K的检测
6.3.7 发酵产物的色价
6.3.8 菌落形态
6.4 讨论
6.4.1 Monacolin K可能的生物合成途径分析
6.4.2 桔霉素、Monacolin K与红曲霉的产孢的关系
6.5 本章小结
参考文献
论文主要结论
论文创新点
附录
致谢
攻读博士研究期间发表论文
发布时间: 2006-07-20
参考文献
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