论文摘要
KRAS基因外显子2上的七个热点突变与转移性结直肠癌患者服用西妥昔单抗等EGFR单抗类药物的疗效密切相关。根据大量的文献报道,携带KRAS突变型的结直肠癌患者对西妥昔单抗应答率很小,而携带KRAS野生型的结直肠癌患者对西妥昔单抗的应答率大大增加。KRAS基因的突变主要是点突变,位于外显子2密码子12、13上的七个突变发生频率可达90%以上。因此,通过检测大肠癌患者KRAS基因的七个热点突变,可以筛选出针对抗EGFR靶向治疗药物有效的患者人群,帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法,从而真正实现肿瘤病人的个体化治疗,还能大幅减少相关治疗费用和毒副作用。另外,进一步的研究指出,KRAS基因为野生型的结直肠癌患者,若携带BRAFV600E突变,也不能从西妥昔单抗治疗中获益。对KRAS野生型的结直肠癌患者再进行BRAF基因V600E的检测,能够进一步筛选出一部分不适合西妥昔单抗等EGFR单抗类药物治疗的KRAS野生型患者。因此,再结直肠癌患者中先进行KRAS七个突变的检测,再进行BRAF V600E的检测,能够更准确筛选出适合西妥昔单抗治疗的结直肠癌患者。为了实现临床对KRAS和BRAF基因突变的检测,建立一种快速、灵敏、重复性好的突变检测方法至关重要。目前已经有很多基于LDR结合测序或者是DNA芯片的突变检测方法,但这些方法都需要昂贵的仪器设备、试剂或是繁琐的实验操作。本研究建立并比较了两种较简便的检测KRAS七个热点突变和BRAF V600E突变的方法,即：缺口-连接酶链式反应（Gap-LCR）法和连接酶检测反应（LDR）法。因为缺口-连接酶链反应（Gap-LCR）法操作繁琐且通量小,所以最终选取了连接酶检测反应（LDR）法检测KRAS七个突变和BRAF V600E。该法操作简便,检测灵敏度高（突变检出率可达5%）,而且无需昂贵的实验设备,能够在普通的实验室或是条件有限的医院里开展。另外,为了提高检测通量,我们采用多重LDR结合Agilent 2100芯片生物分析仪检测法,实现了单孔检测8个突变的基因型,一张芯片检测12人份样本的通量。为了得到准确的检测结果,我们建立了KRAS七个突变和BRAF V600E的阳性质控体系。检测方法建立后,我们应用LDR法结合琼脂糖凝胶电泳对30例石蜡包埋的癌组织样本进行了KRAS七个突变和BRAF V600E的检测,并对其中4例组织样本的测序结果、LDR法结合琼脂糖凝胶电泳结果、LDR结合Agilent 2100芯片生物分析仪检测结果、MassArray法检测结果进行比对。LDR结合琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度高于测序,与MassArray法检测结果相比一致性可达50%,但是还有一部分MassArray法测试为杂合子的没有被检测出来,主要是由于LDR结合凝胶电泳检测结果灵敏度比不上MassArray法。但就其操作的简便性、使用仪器的便捷性、周期短等优点是MassArray法所无法比拟的。