精子差异表达基因原位杂交方法的建立

论文摘要

通过Y精子对X精子扣除杂交获得数段mRNA序列,通过Y精子对X精子扣除杂交获得的序列仅仅只能从理论上推断其属于Y精子差异表达基因序列,尚需进一步通过实验方法确定其属于Y精子差异表达基因序列。本实验旨在建立差异表达基因的精子原位杂交方法。目前尚未见精子RNA原位杂交方法的报道。本实验用Dnae A去除DNA,再进行固定,这样确保了精子RNA与探针杂交。传统的去除精子鱼精蛋白方法造成了精子形态的极大破坏。本实验采用了蛋白酶K去除鱼精蛋白,建立了一种新的差异表达基因序列精子DNA原位杂交方法。对染色体培养低渗时间进行了对比,优化了染色体定位技术。实验选取262bp基因序列在Y精子RNA上是差异表达的。实验选取262bp基因序列在Y精子RNA上差异表达也证明Y-X精子扣除杂交是成功的。实验选取的323bp基因序列位于常染色体上。在37℃下,用浓度为30μg/mL的蛋白酶K处理精子20min能最有效的去除蛋白质。实验选取262bp基因序列位于5号染色体上。解冻的培养基在38.5℃预热2h以上,低渗时间在40min左右能更利于染色体的培养。本实验建立了精子RNA差异表达基因原位杂交方法。建立了一种新的精子DNA原位杂交方法。优化了染色体定位技术。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 精子细胞核染色质研究现状
• 2 精子形态结构研究现状
• 3 精子RNA研究现状
• 4 原位杂交的研究现状
• 第二章 精子RNA差异性表达基因原位杂交
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 样品
• 1.1.2 序列
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 精子标本制备
• 1.2.2 精子RNA提取及cDNA转化
• 1.2.3 探针制备
• 1.2.4 精子FISH
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 精子DNA原位杂交方法的优化及建立
• 实验一 精子原位杂交蛋白酶K浓度的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 3.1 精子原位杂交蛋白酶K浓度优化的理论基础
• 3.2 精子原位杂交蛋白酶K浓度优化的判定标准
• 4 结论
• 实验二 精子差异表达基因序列DNA原位杂交
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 样品
• 1.1.2 序列
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 主要溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 精子标本的制备
• 1.2.2 牛血DNA的提取
• 1.2.3 引物设计及扩增
• 1.2.4 DNA回收
• 1.2.5 探针制备
• 1.2.6 杂交
• 2.结果与分析
• 3. 讨论
• 4 结论
• 第四章 特异表达基因染色体定位
• 实验一 奶牛染色体培养条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 玻片的制作
• 1.2.2 综合培养基的配制
• 1.2.3 染色体的制备
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 3.1 染色体培养的无菌观念
• 3.2 培养基温度对结果的影响及改进
• 3.3 染色体培养低渗时间的优化
• 4 结论
• 实验二 差异表达基因染色体定位
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 序列
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 主要溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 玻片的制作
• 1.2.2 牛血DNA的提取
• 1.2.3 引物设计及扩增
• 1.2.4 DNA回收
• 1.2.5 探针制备
• 1.2.6 杂交
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 第五章 全文结论
• 1 论文总体结论
• 2 本研究的创新点
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历