Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1，3-丙二醇的过程研究

论文摘要

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,可以用作聚酯和聚氨酯的合成单体,因其在纤维工业上的广泛应用而成为近年来研究的热点。目前1,3-丙二醇的生产主要是通过化学法,但是生物转化法因成本较低,可以利用甘油、葡萄糖等可再生资源等优点,受到越来越多的重视。为了使生物转化法生产的1,3-丙二醇在市场上具有竞争力,需要提高1,3-丙二醇的浓度、得率和生产强度。本文对发酵过程中的培养基、通气条件、发酵动力学进行了研究。在此基础上,通过发酵过程中添加有机酸混合液和采取反复补料分批发酵的策略,显著提高了1,3-丙二醇的生产,具体实验结果如下：利用正交实验,分别对种子培养基和发酵培养基进行了优化。在厌氧摇瓶中,利用优化后的发酵培养基,菌体生长和甘油的消耗显著提高,1,3-丙二醇的浓度和得率分别达到6.06 g·L-1和0.41 mol·mol-1,分别比在原始发酵培养基下提高了62%和7.9%。在5-L发酵罐中也得到类似的结果,并且优化后的发酵培养基中酵母提取物和氯化铵的浓度分别比原始发酵培养基显著下降,降低了生产的原料成本。在原始发酵条件下,采取两阶段通气发酵及在发酵后期加入营养物质的策略不能提高1,3-丙二醇的生产。在250-mL摇瓶中,发现装液量增大时,有利于甘油的消耗和1,3-丙二醇的生成。在此基础上,分别研究了以甘油为唯一碳源情况下,不同通气方式对1,3-丙二醇生产的影响。结果显示,发酵过程中全程厌氧通气相比两阶段通气和通入空气,更有利于1,3-丙二醇的生产。在补料分批发酵过程中,菌体的比生长速率随着产物的积累而不断的下降,进而影响到甘油的消耗和1,3-丙二醇的生成。在此基础上,通过甘油的限制性流加,控制菌体的比生长速率,发现在较低的菌体比生长速率下,甘油比消耗速率及其它产物的比生成速率较低,但是乙醇和甲酸的得率很高。随着菌体比生长速率的增加,甘油的比消耗速率和1,3-丙二醇的比生成速率迅速增加,同时乙醇和甲酸的得率迅速下降,1,3-丙二醇的得率大幅度增加。然后,在菌体生长和1,3-丙二醇生成明显减慢的发酵后期,通过控制不同的甘油浓度,发现甘油浓度在15-26 g.L-1时最有利于1,3-丙二醇的生成。最后,采取控制较高的菌体比生长速率和在发酵后期控制适宜甘油浓度相结合的策略,有效的减少了发酵过程中乳酸和乙醇的生成,提高1,3-丙二醇的得率。在不对菌体进行基因工程操作的情况下,通过在发酵过程中外源添加有机酸混合液,有效的提高了1,3-丙二醇的生产,降低了乳酸和乙醇等副产物的生成。在此基础上,分别考察了不同浓度有机酸混合液加入时和在不同发酵时间加入时对发酵结果的影响。结果显示,在菌体浓度（OD650）达到3.0时,加入3.80 mM的有机酸混合液（柠檬酸、琥珀酸和延胡索酸均等浓度）最有利于1,3-丙二醇的生成,在30 h时达到了70 g.L-1以上。在补料分批发酵过程中,产物积累到一定浓度时,就会对菌体生长产生很强的抑制。在厌氧摇瓶中通过反复分批培养,菌体生长和1,3-丙二醇的生产能力保持相对恒定；而在5-L发酵罐中发现,菌体长时间暴露在高浓度的产物中,不利于下一发酵循环的菌体生长。通过初始发酵条件下的反复补料分批发酵,1,3-丙二醇的生产强度为2.86g.L-1.h-1,但其浓度仅为44.60 g.L-1。在此基础上,采取反复补料分批发酵和有机酸添加相结合的策略,1,3-丙二醇生产有了显著的提高。在酵母浸膏代替酵母提取物的基础上,采取多循环的反复补料分批发酵操作,1,3-丙二醇的浓度、得率和生产强度在发酵20 h左右时分别达到66 g·L-1.0.61 mol·mol-1和3.40 g·L-1·h-1左右,显著的提高了1,3-丙二醇的生产。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 1,3-丙二醇简介
• 1.2 PDO生产方法
• 1.2.1 环氧乙烷羰基化法
• 1.2.2 丙烯醛水解法
• 1.2.3 烯醛缩合及其它
• 1.2.4 生物转化法
• 1.3 发酵法生产PDO的研究进展
• 1.3.1 PDO的生产菌
• 1.3.2 不同发酵操作方式的研究
• 1.3.3 甘油代谢途径
• 1.3.4 关键酶
• 1.3.5 底物和产物对发酵的影响
• 1.3.6 发酵模型
• 1.3.7 物料平衡分析
• 1.3.8 菌体的代谢工程改造
• 1.4 未来和展望
• 1.5 研究目的和意义
• 第二章 发酵过程中培养基的优化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 实验菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 实验试剂与仪器
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 种子培养基的优化
• 2.3.2 初始pH对种子培养的影响
• 2.3.3 发酵培养基的优化
• 2.4 本章小节
• 第三章 发酵过程中通气条件对发酵的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 实验试剂与仪器
• 3.2.4 培养方法
• 3.2.5 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 原始发酵条件下的甘油发酵
• 3.3.2 摇瓶培养的通气条件对PDO生产的影响
• 3.3.3 两阶段通气对甘油发酵的影
• 3.3.4 通入空气对甘油发酵的影响
• 3.3.5 全程厌氧通气对甘油发酵的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 补料分批发酵动力学特性
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 实验菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 实验试剂与仪器
• 4.2.4 培养方法
• 4.2.5 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 对照条件下甘油的发酵
• 4.3.2 不同比生长速率对甘油发酵的影响
• 4.3.3 发酵中后期甘油浓度对发酵的影响
• 4.3.4 发酵过程中控制比生长速率和控制甘油浓度的策略
• 4.4 本章小结
• 第五章 发酵过程中添加有机酸对甘油代谢的影响
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与方法
• 5.2.1 实验菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 实验试剂与仪器
• 5.2.4 培养方法
• 5.2.5 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 外源添加有机酸的优化
• 5.3.2 发酵过程中不同浓度有机酸的加入对发酵的影响
• 5.3.3 不同发酵阶段加入有机酸对甘油代谢的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 反复补料分批发酵提高1,3-丙二醇的生产
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料与方法
• 6.2.1 实验菌种
• 6.2.2 培养基
• 6.2.3 实验试剂与仪器
• 6.2.4 培养方法
• 6.2.5 分析方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 发酵产物对菌体生长和甘油代谢的影响
• 6.3.2 反复分批培养的可行性
• 6.3.3 初始发酵条件下的反复补料分批发酵
• 6.3.4 反复补料分批发酵和有机酸添加的耦合实验
• 6.3.5 用酵母浸膏代替酵母提取物的实验
• 6.3.6 多次循环的反复补料分批发酵
• 6.4 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 主要创新点
• 7.3 展望
• 参考文献
• 博士期间撰写和发表文章
• 致谢