导读:本文包含了多肽毒素论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:转录组学,酸敏感离子通道,原核表达,多肽毒素
多肽毒素论文文献综述
苏格[1]（2018）在《基于狼蛛转录组筛选的一种多肽毒素结构和功能研究》一文中研究指出狼蛛在我国有广泛的分布,其毒液中含有种类丰富的多肽毒素,这些毒素可以迅速结合中枢或外周神经系统的重要受体,从而麻痹或是杀死猎物。我国狼蛛资源丰富,但是大部分狼蛛的毒素都没有得到研究。本研究选取分布在云南省的格氏狼蛛为研究对象,挖掘其毒液中具有活性的多肽毒素。利用Illumina测序技术对格氏狼蛛毒腺转录组进行测序和分析,共获得40819个Unigene,通过Blast 比对Nr数据库,获得15005个被注释的Unigene。根据KEGG数据库,对格氏狼蛛毒腺转录组的Unigene进行了 Pathway生物学通路的注释和预测,共有10853个Unigene被注释。从Unigene中查找到5282个SSR位点,占Unigene总数的比例是12.94%。酸敏感离子通道(Acid-Sensing Ion Channels,ASICs)是一种由胞外质子激活的阳离子通道,在多种神经元和非神经元组织中表达。作为质子门控通道,它与许多受pH影响的病理生理功能密切相关,与很多疾病有一定的联系。多肽毒素因为具有高活性高选择性的特点,因此成为研究ASIC结构、功能和生物学作用的重要药理工具。现在有多种ASIC调制剂来自动物多肽毒素如蛇、海葵和蜘蛛等。经过NCBI-BLAST L比对转录组蛋白测序结果后,识别了一条多肽序列(LGTX-F2)。该多肽毒素的相对分子质量为7452Da,由65个氨基酸残基构成,含8个半胱氨酸和4对二硫键,一级结构为AKACTPRLHDCSHDRHSCCRGELFKDVCYCFYPEGEDKTEVCSC QQPKSHKYIEKWDKTKTLVG。为了进一步鉴定 LGTX-F2 的功能,本研究构建LGTX-F2表达载体,并转入大肠杆菌感受态细胞BL21中扩大培养,获得的表达蛋白采用亲和层析方法分离,分离后的融合蛋白用TEV酶切获得目的多肽。采用膜片钳技术进行活性检测,发现LGTX-F2对酸敏感通道有明显的抑制活性。研究发现LGTX-F2能明显的抑制ASICla通道电流,10 μM的LGTX-F2长时间孵育(120 s)后,ASICla抑制率可达93.8±0.5%,同时LGTX-F2对ASICla的电流抑制具有浓度依赖性,其IC50为5.8μM。进一步研究发现,LGTX-F2对ASICla的抑制是可逆的,在10μMLGTX-F2作用120 s后,连续洗脱80 s可使ASICla的电流完全恢复。同时研究了酸敏感通道突变体ASICla F350A对LGTX-F2的作用效果,实验显示抑制率由93.8士0.5%降至66.72士5.6%。同时还探究了毒素对通道质子敏感性的研究发现,LGTX-F2对酸敏感通道不具有pH依赖性。除了 ASICla外,LGTX-F2可以抑制ASIC3通道,在10 μM LGTX-F2毒素的作用下,抑制率可达93.8±0.6%,其IC50为4.6μM。同时,高浓度的LGTX-F2对其他ASICs亚型无明显作用。为了进一步验证LGTX-F2的选择性,筛选了毒素对DGR细胞上钠通道、钾通道和P2X3受体通道的活性,发现LGTX-F2对上述通道基本上无抑制活性。综上所述,本研究从格氏狼蛛毒素转录组学发现了一种多肽毒素LGTX-F2,通过膜片钳活性鉴定发现该毒素是一种酸敏感离子通道抑制剂。LGTX-F2选择性作用于酸敏感离子通道ASICla和ASIC3,可以作为探究癫痫、亨延顿氏病、缺血性脑中风等疾病生理病理机制的工具分子。同时,LGTX-F2是为数不多的对ASIC3具备抑制活性的多肽毒素,而ASIC3是一个治疗细胞外酸化所致疼痛的重要靶点,因此该毒素将有助于进一步加深了 ASIC3与外周疼痛的了解。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2018-08-01）
邵婕,潘娇,瞿芳,刘子昊,丁易颖[2]（2018）在《蜘蛛多肽毒素JZTX-51和JZTX-26的重组表达和纯化》一文中研究指出为建立一种简便、快速且能大量获得富含二硫键的蜘蛛多肽毒素JZTX-26 (35 aa)和JZTX-51 (27 aa)的有效方法,利用PCR的方法克隆成熟肽编码基因并插入至大肠杆菌Escherichia coli表达载体pMAL-p2x中与MBP(麦芽糖结合蛋白)标签融合,构建重组表达质粒pMAL-jz26和pMAL-jz51。在受体菌TB1和BL21(DE3)中对两个重组表达质粒分别进行IPTG诱导表达,通过Amylose亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE分析;采用因子X对融合蛋白进行酶切后通过分子筛以及反相高效液相色谱对两种重组蛋白进行纯化。通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,表达产物的分子量与预期的多肽理论分子量一致。1L表达培养液中能获得大约5mg纯化的目的蛋白JZTX-26或JZTX-51。结果表明利用该原核表达体系可对蜘蛛毒素基因jztx-26和jztx-51进行融合表达,并对重组蛋白进行亲和层析,为采用基因工程的手段大量获得蜘蛛多肽毒素奠定了基础。(本文来源于《生物工程学报》期刊2018年10期）
徐燕[3]（2017）在《作用于ASIC1a通道的多肽毒素的筛选与鉴定》一文中研究指出酸敏感离子通道(ASICs)是一类由胞外酸化所激活的阳离子通道,分为6种亚型,广泛分布于外周和中枢神经系统。近年来已有研究证明ASIC1a在疼痛、学习记忆等方面具有重要功能,同时,也涉及某些病理过程如癫痫、胶质母细胞瘤、缺血性脑中风等。离子通道稳定表达细胞株结合钙荧光成像技术与全自动膜片钳技术无疑将加快调制剂的筛选周期。为此,我们构建了ASIC1a和ASIC3两种离子通道稳定表达细胞株。利用膜片钳技术检测电流密度以及利用倒置相差显微镜观察细胞绿色荧光表达强度的方式来检测细胞株的稳定性,结果显示,稳转细胞株表达离子通道的数目在统计学上未发生显着变化,且荧光强度也未发生显着改变,这证明两种离子通道稳转细胞株已经构建成功。在ASIC1a稳转细胞株的基础上,我们从本实验室的有毒动物毒液中筛选了针对ASIC1a的调制剂。实验发现,从黄金巴拿马蜘蛛毒液分离得到的组分PPCV-21.8在不同条件下扮演着抑制剂或激活剂,因其含量低,并未能纯化到单一成分进行鉴定,但结合蜘蛛毒腺cDNA文库的数据分析,推测cDNA文库分析所得的氨基酸序列是PPCV-21.8发挥作用的关键成分。其氨基酸序列为ADCIPKWKACV NRHGDCCGGL ECWKRRRSFEVCVPKTPKT,包含40个氨基酸残基,3对二硫键。PPCV-21.8可直接激活ASIC1通道。PPCV-21.8增强了ASIC1a对H~+的亲和力,使ASIC1a在pH7.4时脱敏。5μM PPCV-21.8使ASIC1a稳态激活向碱性方向偏移了0.36个pH单位至7.07±0.059。其次,我们还研究了PPCV-21.8对其它ASICs亚型的作用效果,发现18μM PPCV-21.8对ASIC2a无影响;可激活ASIC3电流32.67±4.0%;强烈激活ASIC1b,EC_(50)=1.4μM,同时可加快ASIC1b的开放(无PPCV-21.8时,ASIC1b的上升相τ=0.162±0.029 s,(n=5);在18μM PPCV-21.8作用下,τ=0.042±0.005 s,(n=5),P<0.01),并显着延长通道的脱敏(无PPCV-21.8时,ASIC1b的衰退相τ=0.579±0.107 s,(n=5);在18μM PPCV-21.8作用下,衰退相τ=2.13±0.265 s,(n=5),P<0.01)。用15 nM PPCV-21.8长时间孵育(约200s)后,可抑制ASIC1a电流,抑制率达93.89±1.9%,60 nM PPCV-21.8对其它ASIC亚型无明显影响。最为重要的是,高浓度PPCV-21.8对电压门控钠通道的影响甚小,因此PPCV-21.8对人体具备较高的安全性。综上所述,PPCV-21.8是一个对ASIC1a具有高活性和强选择性的抑制剂,可作为药物先导分子用于疼痛、中风等疾病的治疗且有助于ASICs结构与功能的研究,以便于我们进一步加深对ASICs与生理病理关系的了解和探究其作为疾病治疗的重要靶点的可能性。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2017-12-01）
姚梦[4]（2016）在《大理石纹蝎多肽毒素的基因克隆、原核表达与纯化研究》一文中研究指出大理石纹蝎(Lychas mucronatus)是广泛分布于我国南部以及东南亚等地区的蝎子物种。研究表明大理石纹蝎分泌的毒液中含有大量的生物活性成分,是许多新型药物试剂研发的天然资源宝库。大理石纹蝎子毒液中富含许多有着叁或四对二硫键的小分子多肽毒素。这些多肽类毒素能够高特异性地与多种电压敏感型通道发生作用,进而可以改变电压门控的动力学特征或者阻断通道的离子电流,故而具有着极其重要的生理功能和研究价值。由于从蝎子活体中直接分离出组分不一的多肽蝎毒素是相当的困难,二硫键的存在又使得化学合成按照蛋白质天然构象进行折迭的多肽毒素同样有很大的难度,故而采用基因重组技术来获取高产量的活性多肽毒素逐渐成为研究热点。GT028649和GT028758是从dbEST数据库中检索获得的可能具有生理活性的大理石纹蝎多肽毒素分子。它们分别由62个和63个氨基酸组成,其中都含有八个半胱氨酸,配对形成了四对二硫键。通过RF克隆方法将这两种毒素分子的DNA序列插入到表达载体pET-His-SUMO中,利用大肠杆菌表达系统在E.coli SHuffle菌株中自动诱导表达重组蛋白。表达出的融合蛋白经过镍柱亲和层析和超滤纯化之后,利用Ulp1激酶对其进行消化酶切,切除与目的蛋白相连的His-SUMO融合标签。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步分离纯化酶切液获得高纯度的目的蛋白。使用MALDI-TOF/TOF仪对冻干之后的蛋白样品进行质谱鉴定分析,结果显示表达出的两种蛋白分子量分别为7279.3230Da和7280.6279 Da,与GT028649和GT028758的分子量理论值(分别为7278 Da和7281 Da)相一致,表明实验成功的表达纯化出了含有四对二硫键的蝎毒素分子,后续的实验中也会对这两种表达蛋白产物进行电生理活性检测。本文研究为深入探究蝎毒素的结构功能以及新型多肽类药物的研发等奠定了基础。(本文来源于《国防科学技术大学》期刊2016-11-01）
张凡[5]（2015）在《作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究》一文中研究指出电压门控钠离子通道亚型Nav1.7和Nav1.8参与炎症性和神经病理性疼痛的调节,是治疗慢性疼痛的新型药物靶点。Nav1.7和Nav1.8的抑制剂显示优于吗啡的镇痛活性,然而其非专一性的靶点活性产生严重的副作用。作用于疼痛相关钠通道专一性抑制剂的筛选和结构与功能的研究,有助于新型镇痛药物先导分子的研发和利用专一性多肽探针探究钠离子通道参与疼痛的调节。中华眼镜蛇(Naja atra),属眼镜蛇科,主要分布于我国南方地区。本课题成功从中华眼镜蛇毒液分离纯化出Nav1.8抑制剂,命名为μ-EPTX-Na1a(Na1a)。电喷雾质谱鉴定和Edamn降解测序结果显示,Na1a相对分子质量为7053.63 Da,由62个氨基酸残基组成,含有8个半胱氨酸。结构预测符合典型的蛇毒毒素的叁指结构模型,8个半胱氨酸组成的4对二硫键连接方式为I-III、II-IV、V-VI和VII-VIII。大鼠背根神经节(DRG)细胞上河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道活性检测,Na1a显示对Nav1.8的强抑制活性,IC_(50)为167 nM,1μM的浓度几乎能够抑制全部的Nav1.8钠电流。对DRG上河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道和非失活的Nav1.9活性检测,10μM的Na1a仅具有较弱的抑制活性。检测Na1a对DRG上Nav1.8电生理特性的影响,200 nM Na1a使得Nav1.8的最大激活电压向去极化方向漂移约+10 mV,同时使稳态激活向去极化方向漂移约+11 mV,使稳态失活的向超极化方向漂移约9 mV。洗脱实验显示Na1a能快速结合靶点通道,具有稳定结合活性,同时能够被洗脱。钠离子通道亚型选择性实验结果显示,Na1a能够抑制ND7/23细胞上表达的Nav1.8,IC_(50)为386 nM,10μM的Na1a对Nav1.3,Nav1.7和海马神经元TTX-S钠通道(Nav1.1-1.3)具有较弱抑制活性,10μM Na1a抑制Nav1.4电流约48%,对Nav1.5有抑制作用,IC_(50)为8.51μM,该结果显示Na1a具有较高的专一性。药效学活性实验,Na1a在醋酸扭体疼痛模型,福尔马林疼痛模型和完全弗氏佐剂疼痛模型上具有强于吗啡的镇痛活性,在热板疼痛模型和坐骨神经结扎模型上均具有类似于或略优于吗啡的镇痛活性。同时对Na1a的副作用进行评价:运动功能,30倍镇痛剂量腹腔注射小鼠显示其对其游泳运动时间无明显影响;心脏毒性,对SD新生大鼠心肌Nav1.5的毒性实验显示1μM Na1a约抑制15%的电流;溶血活性和细胞毒活性,35μM浓度下均无两种副作用的表现;心脏安全性评价,10μM Na1a抑制hERG通道电流约为18%。酿酒酵母表达体系成功获得Na1a的异源制备。Na1a的靶点专一性,显着的镇痛活性,弱副作用反应和成功异源制备使其成为一个具有巨大潜力的镇痛药物先导分子。海南捕鸟蛛(Haplopelma hainanum),属捕鸟蛛科,一种主要分布在我国海南省通什县山区的毒性很强的大型蜘蛛。本课题成功地从海南捕鸟蛛毒液中筛选得到Nav1.8的专一性延缓失活剂,命名为δ-TRTX-Hhn1a(Hhn1a)。质谱鉴定和Edamn降解测序结果显示,Hhn1a相对分子质量为3977.62 Da,由34基酸残基组成,含有6个半胱氨酸。结构预测符合抑制剂半胱氨酸节(ICK)模体,6个半胱氨酸组成的3对二硫键连接方式为I-IV,II-V和III-VI。大鼠DRG细胞钠通道活性检测,0.5μM Hhn1a抑制DRG上Nav1.8的峰电流,而2μM Hhn1a则延缓Nav1.8的失活。Hhn1a能够抑制DRG上TTX-S钠离子通道,IC_(50)为4.1μM。亚型选择性结果显示:对异源表达的Nav1.8,Hhn1a同样表现为低浓度抑制峰电流和高浓度延缓失活的特性;对Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5和Nav1.7均表现为抑制活性,IC_(50)分别为3.1±0.08μM、4.2±0.08μM、5.8±0.06μM和2.9±0.03μM。亚型选择性实验证实Hhn1a为Nav1.8的专一性延缓失活剂。Hhn1a可用于探究Nav1.8参与疼痛信号通路调节的分子机制有待进一步探究。海南捕鸟蛛是我国海南省特有的大型剧毒蜘蛛,本实验室在该蜘蛛毒液中发现多种具有重要药理学活性的多肽分子。分析海南捕鸟蛛毒腺的cDNA文库发现,Nav1.7专一性抑制剂μ-theraphotoxin-Hhn2a(HNTX-III)的家族多肽在两个位点存在高突变,即Tyr20突变为His,Ser24突变为Asn。通过色谱分离技术和质谱检测,不能检测到该突变体的天然存在,而HNTX-III在毒液中的含量则可达到1%,这种基因水平存在的天然突变体的生物学活性如何以及其存在的生物学意义是什么。同时,同属HNTX-III家族的HNTX-I,Nav1.7弱抑制活性的HNTX-I的第26位酸性残基组氨酸与强抑制活性的HNTX-III相比突变为碱性天冬氨酸残基,是否这一突变改变HNTX-I对Nav1.7的抑制活性。本实验通过固相化学方法合成了HNTX-III和四个突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N。通过氧化折迭使得二硫键配对,圆二色谱结果检测显示四个突变体CD谱吸收曲线与HNTX-III基本重迭,表明突变没有明显改变其二级结构。因而,正确二级结构的HNTX-III和四个突变体成功制备。本课题检测5个多肽分子对DRG上TTX-S,TTX-R钠离子通道的活性,以及对异源表达钠通道亚型Nav1.3-1.5,Nav1.7,Nav1.8的活性。结果表明,HNTX-III及其天然突变体对TTX-R钠离子通道无抑制活性,对TTX-S钠离子通道具有不同程度的抑制活性。其中,HNTX-III及其突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N对DRG细胞上TTX-S钠通道的IC_(50)分别为0.044μM,4.37μM,0.138μM,2.6μM和1.95μM。因而,Y20,S24,H26的突变降低对DRG TTX-S钠通道的亲和性分别为99.3倍,3.14倍,61.1倍,而双突变-Y20H/S24N降低亲和力仅为44.3倍。对钠离子通道亚型Nav1.7的抑制活性检测显示,HNTX-III及其突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N的IC_(50)分别为0.15μM、9.56μM、1.28μM、7.58μM和2.99μM,因而,Y20,S24,H26和-Y20H/S24N的突变分别降低亲和力为62、8.4、4.9和19.5倍。Nav1.3的抑制活性检测显示,HNTX-III的IC_(50)为0.89μM,突变体-S24N,-Y20H/S24N的IC_(50)则为6.31μM和10.72μM,分别降低7倍和12倍,HNTX-III-Y20H,-H26D则在50μM浓度分别抑制Nav1.3峰电流43%和49%。另外,对Nav1.4,Nav1.5和Nav1.8的抑制活性检测,HNTX-III和四个突变体在10μM浓度下均无抑制活性。同时对分别检测了HNTX-III和四个突变体对DRG-TTX-S钠通道,Nav1.7和Nav1.3的I-V,激活和失活的影响,发现均无显着改变。突变体活性的显着差异表明Try20,Ser24和His26是HNTX-III抑制钠通道的关键残基。HNTX-III的叁维结构解析证实了这一结果。综上结果推测,自然选择帮助和保留了最强抑制钠离子通道活性的毒液主要组分HNTX-III,用以防卫和捕食。同时,HNTX-III的叁维结构数据的测定和分析,表明其结合钠离子通道的关键残基位于C末端的2个活性区域,为基于结构和活性位点的分子改造和靶点药物设计提供了良好的的前期研究。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2015-06-01）
张亦雅[6]（2015）在《两种捕鸟蛛多肽毒素的分子多样性及其机制研究》一文中研究指出蜘蛛毒液是不同生物学活性的毒素成分构成的复杂混合物,它在蜘蛛捕食和防御过程中扮演着至关重要的作用。多肽毒素是蜘蛛毒液的主要成分之一,其相对分子质量较小,具有结构稳定、高活性、高选择性等特征同时表现出丰富的结构多样性。尽管我们在过去的几十年中对蜘蛛多肽毒素进行了大量的研究,但是,毒素组的研究策略大多限制在对高丰度的多肽毒素的分析。因此为了更好地研究蜘蛛多肽毒素分子多样性及其遗传进化机制,需要获取更全面的多肽毒素序列信息。在本研究中,我们将第二代测序技术与蛋白组学分析相结合,从而快速高效地揭示虎纹捕鸟蛛多肽毒素的多样性。通过454测序,从虎纹捕鸟蛛毒腺中获取了123,922条reads序列(总共约42Mb数据),reads序列长度范围为40 bp-836 bp,平均长度为~327 bp。通过序列对比,32,267 reads序列与已知毒素序列有高度相似性,占所有reads的29%;44%reads鉴定为编码细胞相关蛋白序列;“未知功能”的reads序列占整个鉴定的reads的7%;含有多个半胱氨酸结构但在公共数据库无匹配序列的“推测的毒素”(Putative Toxins)占整个reads的0.1%;剩余的未匹配序列占20%。经过生物信息学分析,最终得到626条毒素前体序列。依据其序列相似性,毒素前体可分为16个超家族,其中包括10个已知的超家族和6个新的超家族。在毒腺转录组中鉴定到了大量低表达的毒素突变体,由基因突变、片段的插入/缺失等是这些毒素突变体产生的重要因素。此外,毒素的种内可变性与丰富的多肽毒素导致了蜘蛛毒腺是一个动态变化的毒素库,蜘蛛多肽毒素动态变化使蜘蛛在捕食和防御过程中能够快速地适应环境。为了研究海南捕鸟蛛多肽毒素结构和功能多样性的机制,我们将以第二代高通量测序为基础的转录组学与多肽组学相结合,分析海南捕鸟蛛多肽毒素的序列特征,并利用膜片钳技术分析了14种蜘蛛多肽毒素的生物学活性。通过454测序,从海南捕鸟蛛毒腺中获取249,549条reads序列,reads序列长度范围为40 bp-830 bp,平均长度为~328 bp。通过序列对比,52,570条reads序列与已知毒素序列有高度相似性,占据所有reads的26%;“推测的毒素”(Putative Toxins)占整个reads的5%;44%的reads为编码细胞相关蛋白序列;“未知功能”的reads序列占整个鉴定的reads的5%;而剩余的未匹配序列占20%。通过生物信息学分析,最终获得了1,136条毒素前体并归类为90种多肽毒素,包括18种已知多肽毒素和72种新发现的毒素。依据其半胱氨酸框架,多肽毒素可分为20大类,其中14类半胱氨酸框架在海南蜘蛛毒素中首次被发现。此外,高度多样化的蜘蛛毒素表现出多样的生物学功能,它们相互协作,作用于多种离子通道,有利于蜘蛛的捕食与防御。心脏离子通道在维持正常的心脏电生理活性过程中发挥着重要的作用,通过调节静息膜电位和兴奋性,参与动作电位的去极化和复极化,决定心肌动作电位的形状和时程。先天性的编码基因突变或药物阻断导致的心肌离子通道功能障碍,不仅可以改变心肌的兴奋性,同时也可以影响心肌动作电位的去极化和复极化,从而导致长QT综合征/短QT综合征、不同类型的心率失常或者其它心脏传导紊乱。所以,心肌离子通道是抗心率失常药物的重要靶标。蜘蛛毒液包含有丰富的多肽毒素,这些多肽毒素能高效地、特异地与多种离子通道相结合,在药理学、神经生物学和医学领域有很好的应用前景。但是,蜘蛛毒素对心肌电生理影响的研究较少。在本研究中,我们分析了虎纹捕鸟蛛和海南捕鸟蛛的粗毒对新生大鼠心室肌细胞电生理的影响,包括动作电位(AP),电压门控钠离子通道电流(INa)、瞬时外向钾电流(Ito)、快激活延迟整流型钾电流(IKr)、慢激活延迟整流型钾电流(IKs)、内向整流型钾电流(IK1)和L型钙电流(ICa L)。结果表明:100μg/m L的虎纹捕鸟蛛和海南捕鸟蛛粗毒都能很明显的延长心肌动作电位时程(APDs)。100μg/m L虎纹粗毒能明显抑制72.3±3.6%的INa电流;58.3±4.2%的IKr总电流;54±6.1%的IKr尾电流和65±3.3%的ICa L电流,但是对IKs、Ito1和IK1电流无明显影响。相似地,100μg/m L海南粗毒能明显阻断INa电流和ICa L电流,但对心肌钾离子通道电流(Ito1、Iks、Ikr和Ik1)无明显影响。蜘蛛粗毒表现出的多种的药理学特性表明:蜘蛛粗毒含有多种心肌离子通道拮抗剂,在心肌离子通道特性的研究和心脏疾病的治疗方面有很好的应用前景。综上所述,本课题使用转录组学、多肽组学以及膜片钳技术相结合的方法对两种捕鸟蛛毒素组分进行了一个整体而系统的研究,揭示了两种捕鸟蛛多肽毒素的分子多样性及其机制。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2015-05-01）
孙培蓓[7]（2015）在《应用膜片钳电生理技术研究多肽毒素对钾离子通道的作用机制》一文中研究指出离子通道是膜蛋白的一种,它在生命活动中起着非常重要的作用。由于离子通道的一些突变会导致人类疾病,因此相关药理学方面的研究也非常重要。目前对离子通道的研究主要有利用X射线晶体衍射或者液体核磁共振技术解析它们的结构,利用膜片钳电生理技术研究它们的功能等等。动物多肽毒素通常能够作用于离子通道,调节它们的开放和关闭。它们是研究离子通道结构与功能的工具,同时也能被改造或修饰,用于疾病的治疗。本文中我们主要用蛋白异源表达纯化的方法获得多肽毒素,用液体核磁共振技术以及膜片钳电生理技术研究动物多肽毒素和钾离子通道的相互作用。论文共分为四个章节。第一章介绍了钾离子通道和相关动物多肽毒素的基本知识。包括钾离子通道的类型,钾离子通道相关疾病以及多肽毒素的种类、结构,与钾离子通道相互作用模式等。第二章对膜片钳电生理技术作了简单的介绍,包括膜片钳的几种基本模式以及衍生技术,主要的相关设备等。第叁章是蜈蚣多肽毒素SSD609对KCNQ1/KCNE1钾离子通道作用机制的研究。作用于KCNQ1/KCNE1钾离子通道的多肽毒素很少,目前只有两篇文章报道过相关内容,蜈蚣毒腺中提取的SSD609就是其中的一种。而KCNQ1/KCNE1钾离子通道与人类心脏疾病密切相关,作用于它的毒素有潜在的作为药物的可能。本章我们通过大肠杆菌异源表达纯化的方法获得较为大量的SSD609多肽毒素,通过膜片钳电生理技术验证其抑制Iks电流的功能,证明其与天然状态的毒素拥有类似的生理功能。之后利用液体核磁共振技术解析了它的结构,由叁段α螺旋构成,此结构在动物多肽毒素中非常少见。根据结构和功能提供的信息,猜测其作用于KCNE1辅助亚基,因此设计了KCNE1上相关位点的突变,结合电生理实验推断出SSD609与KCNQ1/KCNE1可能的相互作用方式,首次提出多肽毒素作用于辅助亚基,这为以后进一步的研究打下基础。第四章主要介绍了蝎毒素IbTX的表达纯化以及它对BK钾离子通道的抑制作用。异源表达多肽毒素为一种获取毒素的常用方法,相对来说这种方法时间短、花费少,而且可以对毒素做些简单的改造。融合标签能够帮助多肽毒素表达,但用酶切的方法除去标签时容易引入多余氨基酸残基。本章我们使用两种不同的酶来切除IbTX的融合标签,使用膜片钳电生理技术研究它们对BK钾离子通道的作用,证明有时候多余一个氨基酸会对多肽毒素的功能产生较大的改变。(本文来源于《中国科学技术大学》期刊2015-03-01）
刘中华[8]（2014）在《蜘蛛多肽毒素及其新药发现》一文中研究指出目的"以毒攻毒"是中药等传统医药治疗人类疑难杂症的一个重要策略。多肽毒素是有毒动物的主要药用活性成份。近年来,挖掘和利用动物多肽毒素资源已成为国际新药研发的新模式,竞争激烈。蜘蛛毒是动物多肽毒素研究的重要组成部分,是继芋螺、蝎、蛇等毒素之后的另一个研究热点。相对于其它有毒动物,蜘蛛物种资源最丰富,其多肽毒素呈现了极大的分子多样性,作为一个崭新的多肽毒素资源日益受到关注。阐明蜘蛛多肽毒素与离子通道选择性作用的分子机制并在此基础上开展新药研发是本研究的关键科学问题和目的所在。方法利用转录组学、多肽组学、膜片钳电生理分析、动物药效学分析等技术路线开展研究。结果 以蜘蛛多肽毒素为对象,在结构与功能、毒理学研究以及新药研发方面,取得了一系列创新性成果,主要包括:(1)发现多个具有重要药用前景的多肽毒素,如高专一性的N-型钙通道阻断剂HWTX-X、钠通道Nav1.7亚型抑制剂HNTX-Ⅲ和HNTX-Ⅳ、选择性抗肿瘤活性肽lycosin-I等,并深入开展了结构与功能关系研究;(2)在深入开展了HNTX-III抑制Nay1.7的新作用模式和分子机制研究的基础上,结合其他蜘蛛多肽毒素与钠通道的相互作用研究,较系统地总结了蜘蛛多肽毒素与钠通道选择性相互作用的分子机制和规律,为靶向钠通道亚型的新药研发提供了重要理论依据;(3)首次报道了蜘蛛多肽毒素的抗肿瘤活性,并阐明了其作用机制;(4)完成了虎纹镇痛肽的临床前研究,现正开展临床Ⅰ期试验,同时正主持开展抗肿瘤多肽药物、新型急性胰腺炎药物、新型镇痛药物等多个多肽新药的临床前研究。结论通过前期研究证明了蜘蛛多肽毒素的生物学多样性以及作为新药研发资源的重要性,因此如何基于前期研究成果开展应用研发是未来本研究的重点。通过组建多肽药物湖南省工程实验室,针对于目前国际研究热点和难点,进一步深入阐明重要药用前景蜘蛛多肽毒素结构与功能关系以及选择性相互作用的分子机制等关键科学问题,并在此基础开展创新性多肽药物研发,促进研究成果转化以及提升多肽研发的创新力。(本文来源于《中国毒理学会第四届中青年学者科技论坛论文集》期刊2014-08-13）
张科军,李力,戴秋云[9]（2013）在《富含二硫键多肽毒素的表达与纯化》一文中研究指出富含二硫键的多肽毒素一般分子量小,二硫键密集,体外折迭效率较低,多于40个氨基酸的序列较难用化学合成方法得到目标产物。简要综述富含二硫键的多肽毒素(如芋螺毒素、蝎毒和蜘蛛毒素等)基因工程表达研究进展,着重阐述其在大肠杆菌、酵母表达体系中表达及纯化技术特点。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2013年11期）
霍林巨[10]（2013）在《斑络新妇蛛多肽毒素分子多样性研究》一文中研究指出斑络新妇蛛是在分布于中国,日本,越南等地的一种有毒蜘蛛。它的毒液由许多具有不同生物活性物质组成。为了更好地开发利用该生物资源,阐明斑络新妇蛛毒素分子多样性及其遗传进化机制是非常重要的。我们取斑络新妇蛛的毒腺建立cDNA文库,随机挑取单克隆进行测序,共得到高质量的EST总数为1380条,有效序列最短为127 bp,最长为1089 bp,平均长度为578 bp。1380个EST序列经归类后得到601个唯一序列(Unique sequence),包括85个重迭群(contigs)和516个单一序列(singletons)。其中,蜘蛛毒素基因有460个,包括59个重迭群和401个单一序列,占整个转录组的76.53%;与通常细胞蛋白有关的基因113个,包括16个重迭群和97个单一序列,占整个转录组的18.80%。另外还有4.67%没有匹配到与数据相似的序列或者相似性非常低。序列提交到GenBank,序列收录号为KF433089-KF433818。在所得的斑络新妇蜘蛛毒腺cDNA文库中,共获得460个毒素类多肽,占所有测序的表达序列标签的比例为33.33%,去冗余后可得431条全长的毒素前体(含有信号肽,富含酸性氨基酸残基的中间肽和成熟肽)。根据毒素前体肽序列的相似性,采用MEGA5.1 Neighbor-joining Bootstrap method(邻接法)对所有斑络新妇蜘蛛毒素前体肽构建构建进化树。结果显示,所有毒素前体肽被分成13个超家族(超家族A-M),并且有些毒素超家族还包含它们的相关家族。另一方面,对普通细胞蛋白相关的转录子进行的基因注释揭示了一些新的可能的毒素成分和毒囊重要细胞生理过程的相关成分,比如蛋白翻译后修饰,细胞运动,蛋白质合成,能量供应等等。斑络新妇蛛毒腺的转录组分析和基因的注释展示了毒腺这个特化的产毒器官中的生理概况。蜘蛛粗毒中富含生物活性物质,从盐到多结构域蛋白质,尤其以多肽类成分为主。我们利用离子交换、色谱技术分离纯化了斑络新妇蜘蛛毒素粗毒,并通过质谱鉴定了分离纯化到的蜘蛛毒素成分,利用膜片钳技术研究了斑络新妇粗毒对DRG的影响作用,我们发现斑络新妇粗毒对DRG TTX-R型电流、DRG TTX-S型电流有一定抑制作用,还观察到细胞毒作用。在接下来的工作中,我们将继续深入进行斑络新妇蜘蛛毒素的结构及功能研究,包括斑络新妇蜘蛛毒素对昆虫的活性作用研究。另外,我们基于高通量化酵母双杂交技术对研究ASICS相互作用蛋白质的优势,将ASIC1a、ASIC2a亚基胞外环基因分别构建到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上,成功构建了 2个酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-ratA1a和pGBKT7-ratA2a,完成了所构建载体的表达及鉴定工作。2个酵母双杂交诱饵载体自激活以及阳性、阴性对照实验。将两个酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-ratA1a和pGBKT7-ratA2a通过library scale的高通量筛选虎纹捕鸟蛛cDNA文库,经过初步筛选得到1288个准阳性克隆,经SD/_Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Ga 验证及显色反应筛选到6个与ASIC1a、ASIC2a相互作用的克隆,提取克隆完成质粒测序,为后续ASICs相互作用的蛋白质的研究工作奠定了实验基础。敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)是近几年在我国发现的又一蜘蛛物种,分布于广西及海南等地。它的毒液是由许多生物活性成分组成的复杂混合物。我们在敬钊缨毛蛛粗毒中分离得到了敬钊毒素-58(JZTX-58],为了对JZTX-58毒素进行更深入的研究,克隆了敬钊毒素-58(JZTX-58]的基因。并且通过采用表达质粒pVT102U/α和酿酒酵母S78菌株构成的真核表达系统,经过分离纯化、质谱分析鉴定成功表达得到敬钊毒素-58(JZTX-58]蛋白质。我们将继续深入进行敬钊毒素-58(JZTX-58]的结构及功能研究,尤其是我们推测的JZTX-58可能具有抗疟原虫的活性的研究。综上所述,我们构建了斑络新妇蛛的毒腺cDNA文库,利用分子生物学、生物化学、质谱、膜片钳及生物信息学等技术对斑络新妇蛛毒腺的转录组进行了研究,分离鉴定到一批可能具有较高活性的蜘蛛毒素成分,研究分析了斑络新妇蜘蛛多肽毒素的分子多样性,功能和进化的关系,初步对斑络新妇蜘蛛毒素粗毒进行了功能研究分析,为进一步研究斑络新妇蜘蛛毒素的功能打下了基础。我们基于高通量化酵母双杂交技术对ASICS相互作用蛋白质进行了研究,通过构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-ratA1a和pGBKT7-ratA2a通过library scale的高通量筛选虎纹捕鸟蛛cDNA文库,经过初步筛选得到1288个准阳性克隆,筛选到6个与ASIC1a、ASIC2a相互作用的克隆,为后续ASICs相互作用的蛋白质的研究工作奠定了实验基础。我们成功克隆了敬钊毒素-58(JZTX-58]的基因。并表达得到JZTX-58蛋白质,为我们进一步研究敬钊毒素-58(JZTX-58]蛋白质可能具有的抗疟原虫的活性的研究奠定了重要的基础。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2013-10-01）
多肽毒素论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为建立一种简便、快速且能大量获得富含二硫键的蜘蛛多肽毒素JZTX-26 (35 aa)和JZTX-51 (27 aa)的有效方法,利用PCR的方法克隆成熟肽编码基因并插入至大肠杆菌Escherichia coli表达载体pMAL-p2x中与MBP(麦芽糖结合蛋白)标签融合,构建重组表达质粒pMAL-jz26和pMAL-jz51。在受体菌TB1和BL21(DE3)中对两个重组表达质粒分别进行IPTG诱导表达,通过Amylose亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE分析;采用因子X对融合蛋白进行酶切后通过分子筛以及反相高效液相色谱对两种重组蛋白进行纯化。通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,表达产物的分子量与预期的多肽理论分子量一致。1L表达培养液中能获得大约5mg纯化的目的蛋白JZTX-26或JZTX-51。结果表明利用该原核表达体系可对蜘蛛毒素基因jztx-26和jztx-51进行融合表达,并对重组蛋白进行亲和层析,为采用基因工程的手段大量获得蜘蛛多肽毒素奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
多肽毒素论文参考文献
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[3].徐燕.作用于ASIC1a通道的多肽毒素的筛选与鉴定[D].湖南师范大学.2017
[4].姚梦.大理石纹蝎多肽毒素的基因克隆、原核表达与纯化研究[D].国防科学技术大学.2016
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