论文题目: 日本结楼草（Zoysia japonica Steud.）植株再生体系建立与DREB1A基因转化研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 森林培育
作者: 齐春辉
导师: 韩烈保
关键词: 日本结缕草,胚性愈伤组织,植株再生,基因枪,农杆菌,基因转化
文献来源: 北京林业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究通过单因素实验和多因素正交实验探讨了多个因素对日本结缕草（Zoysia japonica Steud.）不同外植体愈伤组织诱导及生长的影响,建立了高效的离体植株再生体系。在此基础上,通过基因枪轰击和农杆菌侵染对日本结缕草的遗传转化进行了研究,确立了两种转化方法的技术路线,并且将DREB1A基因转入日本结缕草不同品种中,以期获得更为抗旱、耐寒、耐盐碱的日本结缕草转基因新品系。通过近4年的研究,在以下几个方面取得了进展: 1、建立了日本结缕草离体植株再生体系。以成熟种子诱导愈伤组织,单因素实验和正交实验结果表明,选用品种‘Zenith’,在MS培养基中以植物凝胶作为凝固剂,添加2,4-D 5mg/L、6-BA或KT 0.1mg/L及CuSO4 2.5mg/L的组合效果最好。无菌实生苗各部分中,胚轴的胚性愈伤诱导培养基可选用2～3mg/L的2,4-D,添加0.05mg/L 6-BA;MS培养基添加2～4mg/L 2,4-D即可诱导芽尖获得较高的胚性愈伤率,但芽尖不易操作。胚性愈伤组织继代时要仔细挑选,继代周期为24～33d。植株再生率取决于愈伤组织的质量,1/2MS+KT 0.2mg/L培养基由于符合体细胞胚的发育,效果较好。 2、确立了日本结缕草转化子筛选方案。对于基因枪法,采用延迟筛选的方式,愈伤组织轰击后恢复培养5d,然后转入含有50mg/L潮霉素的愈伤组织继代培养基上,每月继代一次,筛选2个月,抗性植株再生培养基中,潮霉素浓度降至20mg/L;对于农杆菌介导转化法,转化子筛选过程中潮霉素用量与基因枪转化系统相同,但附加200mg/L头孢霉素作为抑菌剂。 3、建立了日本结缕草基因枪转化体系。其技术要点为:1100psi的轰击压力下,选用直径为1μm的金粉、每枪500μg金粉+1μg DNA、6cm的轰击距离、轰击两次的基因枪转化参数,选择诱导4个月、继代培养25d左右的胚性愈伤组织进行基因枪轰击,靶材料在轰击前4h至轰击后12h间,培养于含有甘露醇及山梨醇各0.2M的高渗培养基上。 4、建立了日本结缕草农杆菌介导转化体系。主要采用以OD600为0.5的农杆菌LBA4404菌液侵染转化经过预培养的胚性愈伤组织20min（0.08MPa真空处理5min）,共培养2d后洗去农杆菌,将愈伤组织转至含潮霉素和头孢霉素的筛选培养基上。在工程菌液及共培养基中均添加100μM乙酰丁香酮。 5、获得了转入DREB1A基因的日本结缕草。以基因枪转化‘Zenith’、‘Liaoning’和‘Qingdao’3个品种,获得移栽成活的潮霉素抗性株系16株,‘Zenith’、‘Liaoning’和‘Qingdao’3个品种的抗性植株获得率分别5.6%、7.62%和2.08%。农杆菌介导转化‘Zenith’,获移栽成活抗性植株2株,抗性植株
论文目录:
独创性声明
摘要
ABSTRACT
目录
缩写词
第一章 综述
1．1 转基因技术在草坪草育种上的应用
1．1．1 离体培养及植株再生体系的建立
1．1．1．1 胚性愈伤组织、细胞悬浮系与原生质体培养
1．1．1．2 植株再生
1．1．2 草坪草遗传转化体系的建立
1．1．2．1 原生质体转化方法
1．1．2．2 不依赖于原生质体的转化方法
1．1．2．3 其它转化方法
1．1．3 表达载体的构建
1．1．4 转化体筛选与转基因植株的鉴定
1．1．4．1 利用标记基因筛选
1．1．4．2 生长试验
1．1．4．3 遗传鉴定
1．1．5 草坪草育种中应用转基因技术存在的问题
1．1．5．1 基因型的限制
1．1．5．2 组织培养过程中变异的发生
1．1．5．3 基因转化体系的完善与扩展
1．1．5．4 外源基因的高效表达
1．1．5．5 标记基因的去除
1．1．5．6 转基因草坪草向大田释放的风险性
1．1．6 转基因技术在草坪草育种中应用的发展前景
1．2 日本结缕草基因工程研究进展
1．2．1 日本结缕草离体植株再生
1．2．2 日本结缕草的遗传转化
1．2．2．1 基因转化
1．2．2．2 基因表达
1．2．3 应用转基因技术培育日本结缕草新品种的育种方向
1．2．3．1 延长绿期
1．2．3．2 提高抗性
1．2．3．3 抗除草剂
1．3 DREB转录因子及其在植物中的转化
1．3．1 渗透胁迫应答基因
1．3．2 DREB转录因子
1．3．3 DREB转录因子在植物中的转化
1．4 本研究意义、目标和内容
1．4．1 选题背景与研究意义
1．4．2 研究目标
1．4．3 主要研究内容
第二章 日本结缕草植株再生体系的建立
2．1 材料与方法
2．1．1 材料
2．1．1．1 植物材料
2．1．1．2 培养基
2．1．2 种子的消毒
2．1．3 愈伤组织的诱导与继代
2．1．4 愈伤组织生长量的测定
2．1．5 愈伤组织的分化与植株再生
2．1．6 试验设计
2．1．7 数据统计
2．2 结果与分析
2．2．1 以日本结缕草种子为外植体诱导愈伤组织
2．2．1．1 预处理对日本结缕草成熟种子愈伤诱导率的影响
2．2．1．2 不同因素对日本结缕草种子诱导愈伤组织的影响
2．2．1．3 日本结缕草种子诱导愈伤的多因素正交实验
2．2．2 以无菌实生苗各部分为外植体诱导愈伤组织的正交实验
2．2．2．1 以胚轴、根段及幼芽诱导愈伤组织的正交实验
2．2．2．2 以芽尖诱导愈伤组织的正交实验
2．2．3 愈伤组织生长曲线的测定
2．2．4 不同培养基对植株再生的影响
2．3 结论与讨论
2．3．1 外植体的选择
2．3．2 基因型对愈伤组织诱导的影响
2．3．3 激素的协同作用对日本结缕草愈伤组织诱导的影响
2．3．4 愈伤组织继代与胚性的维持
2．3．5 植株再生
第三章 DREB1A基因导入日本结缕草的研究
3．1 材料与方法
3．1．1 材料
3．1．1．1 受体植物材料
3．1．1．2 细菌和质粒
3．1．2 培养基
3．1．2．1 细菌培养基
3．1．2．2 受体材料培养基
3．1．2．3 基因枪转化用培养基
3．1．2．4 农杆菌介导转化用培养基
3．1．3 质粒DNA的制备
3．1．3．1 大肠杆菌受体细菌的培养
3．1．3．2 大肠杆菌感受态细胞的制备
3．1．3．3 质粒的转化
3．1．3．4 质粒DNA的提取
3．1．4 重组质粒由大肠杆菌向农杆菌中转移
3．1．5 基因枪转化
3．1．5．1 金粉DNA复合体的制备
3．1．5．2 受体材料的处理
3．1．5．3 受体材料的轰击
3．1．5．4 转化子的筛选
3．1．5．5 GUS表达的检测
3．1．6 农杆菌介导转化
3．1．6．1 农杆菌的培养与活化
3．1．6．2 农杆菌介导的遗传转化
3．1．6．3 抑菌剂对农杆菌和外植体生长的影响
3．2 结果与分析
3．2．1 不同因素对日本结缕草基因枪转化效率的影响
3．2．1．1 筛选压的确定
3．2．1．2 基因枪转化参数的多因素正交实验
3．2．1．3 金粉直径对转化效率的影响
3．2．1．4 渗透处理对转化效率的影响
3．2．1．5 预培养对转化效率的影响
3．2．1．6 延迟筛选对转化效率的影响
3．2．1．7 受体状态对转化效率的影响
3．2．1．8 日本结缕草不同品种间转化效率的差异
3．2．2 不同因素对日本结缕草农杆菌介导转化效率的影响
3．2．2．1 抑菌剂浓度的确定
3．2．2．2 菌液浓度对转化效率的影响
3．2．2．3 侵染时间对转化效率的影响
3．2．2．4 共培养时间对转化效率的影响
3．2．2．5 预培养对转化效率的影响
3．2．2．6 乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响
3．2．2．7 真空处理对转化效率的影响
3．2．3 基因枪与农杆菌转化效率的差异
3．3 结论与讨论
3．3．1 日本结缕草遗传转化体系
3．3．2 受体对转化效率的影响
3．3．3 筛选方案对转化效率的影响
3．3．4 转化方法对转化效率的影响
3．3．5 DREB1A基因的导入对日本结缕草生长的影响
第四章 抗性植株的检测
4．1 材料与方法
4．1．1 植物材料
4．1．2 组织化学染色
4．1．3 抗性植株的分子检测
4．1．3．1 植物DNA的提取
4．1．3．2 抗性植株的PCR分析
4．1．3．3 抗性植株的Southern印迹杂交
4．2 结果与分析
4．2．1 GUS检测
4．2．2 抗性植株的分子检测
4．3 结论与讨论
第五章 结论
参考文献
附图
个人简介
导师简介
获得成果目录清单
致谢
发布时间: 2005-07-12
参考文献
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