蜡梅再生体系初探与蜡梅花发育各时期cDNA-SRAP差异显示

论文摘要

蜡梅（Chimonanthus praecox （L.） Link）是蜡梅科蜡梅属的落叶灌木,为我国的传统名花,冬季著名的香花植物,也是重要的园林绿化植物之一。虽然近几十年来,人们对蜡梅的种质资源、品种分类、园林应用等很多方面进行了较广泛的研究,但是作为木本植物,蜡梅的组培快繁,特别是再生方面存在很多困难,进展并不多。现在随着分子生物学方面的快速发展,对蜡梅基因层面的研究也逐步开展,已有一些抗逆相关、花香相关基因相继克隆出来的报道,蜡梅的分子研究领域已成为研究热点。本研究从两方面切入,一方面利用薄层培养、体细胞胚发生等方法初步探索了建立蜡梅再生体系的方法；另一方面,运用cDNA-SRAP标记方法,以‘H29’号蜡梅单株为研究材料,对蜡梅花发育的各个时期所呈现的表达差异进行了分析研究。主要研究结果如下：1蜡梅再生体系的初步探索（1）以蜡梅的下胚轴和子叶作为外植体材料,进行器官发生途径的再生实验,结果表明两种外植体在1/2MS+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L的培养基上易形成愈伤组织,并且有根的分化。（2）以下胚轴和子叶作为外植体材料,进行间接体细胞胚胎发生途径的再生实验,外植体在MS+2.4-D2.0mg/L的培养基上暗培养,可诱导出黄绿色,较疏松,活力较高的愈伤组织,诱导率100%,且实验得出下胚轴比子叶的诱导愈伤效果好。（3）通过多次继代,组培苗生长势减弱,出现叶色发红,节间缩短等现象,在1/2MS+BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L的茎尖继代培养基基础上进行优化,结果在优化培养基MS+BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+NAA 0.2mg/L上植株生长健壮,丛生化和红叶现象减少,增值系数和成苗率得到提高。2蜡梅花发育的cDNA-SRAP差异显示cDNA-SRAP分子标记技术操作简便,成本较低,重复性好,能产生较丰富的条带,因此运用该方法进行差异显示的分析研究是一种有效可行的途径。本实验利用cDNA-SRAP分子标记技术,使用了170对引物,筛选出其中效果较好的19对引物,对从8月份到12月所采集的24个蜡梅花芽样品所制备的cDNA模板进行扩增,最终扩增出586条有差异片段,回收其中的82条进行克隆,获得阳性克隆49个,测序后进行比对,最终得到与植物有关的序列23条。经过比对找到5个同源蛋白和一些转录因子、转座子、逆转录转座子相关的序列,并对这些基因片段的功能进行了分析与预测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 蜡梅再生体系研究初探
• 1 文献综述
• 1.1 蜡梅的生物学特性及习性
• 1.2 蜡梅的品种分类
• 1.3 蜡梅的生产与应用
• 1.3.1 园林应用
• 1.3.2 蜡梅的其他应用价值
• 1.4 植物组织培养的研究进展
• 1.4.1 组织培养技术及木本植物组织培养
• 1.4.2 体细胞胚胎发生途径的再生研究
• 1.4.3 薄层细胞培养技术
• 1.4.4 蜡梅组织培养的研究概况
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 外植体材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养基制备及外植体消毒
• 2.2.1.1 培养基制备
• 2.2.1.2 外植体消毒
• 2.2.2 薄层培养
• 2.2.3 子叶及下胚轴再生
• 2.2.4 体胚途径再生
• 2.2.4.1 愈伤组织诱导
• 2.2.4.2 胚性愈伤诱导
• 2.2.5 快繁体系继代培养基优化
• 2.2.6 数据统计
• 3 结果分析
• 3.1 不同消毒方法对外植体初代的影响
• 3.2 薄层培养（thin cell layer,TCL）
• 3.3 子叶及下胚轴再生
• 3.4 体胚途径再生
• 3.4.1 愈伤组织诱导
• 3.4.2 胚性愈伤诱导
• 3.5 快繁体系继代培养基的优化
• 4 讨论
• 4.1 种子无菌萌发
• 4.2 体胚途径再生,褐化问题
• 4.3 继代培养基优化
• 第二章 蜡梅花发育各时期的CDNA-SRAP差异显示
• 1 文献综述
• 1.1 蜡梅的分子生物学研究概况
• 1.1.1 利用标记辅助蜡梅的品种分类与鉴定以及遗传多样性分析
• 1.1.2 蜡梅功能基因的克隆与生物学分析
• 1.2 差异显示研究概况
• 1.2.1 mRNA差异显示PCR（differential display PCR,DDRT-PCR）
• 1.2.2 cDNA代表性差示分析（cDNA representational difference analysis,RDA）
• 1.2.3 抑制消减杂交法（subtractivehybridization,SSH）
• 1.2.4 基因表达系列分析（Serialanalysisofgeneexpression,SAGE）
• 1.2.5 cDNA微阵列（microarray）
• 1.2.6 cDNA扩增片段长度多态性（cDNA amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP）
• 1.3 SRAP标记概述
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 实验材料、试剂与实验方法
• 2.1 植物材料、仪器与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 主要试剂及溶液配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 总RNA的提取及纯化
• 2.2.1.1 RNA的提取
• 2.2.1.2 RNA的纯化
• 2.2.2 cDNA第一链的合成及检测
• 2.2.2.1 cDNA第一链的合成
• 2.2.2.2 cDNA第一链的质量检测
• 2.2.3 cDNA-SRAP扩增及差异片段的回收
• 2.2.3.1 cDNA-SRAP扩增
• 2.2.3.2 PCR产物检测
• 2.2.3.3 差异片段的回收
• 2.2.4 目的片段的克隆筛选及测序分析
• 2.2.4.1 DH5α感受态的制备
• 2.2.4.2 目的片段与PCR（?）2.1载体的连接
• 2.2.4.3 片段与载体连接产物转化DH5α感受态
• 2.2.4.4 菌落PCR检测
• 2.2.4.5 阳性克隆的测序与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA的提取及纯化
• 3.2 cDNA第一链的合成及检测
• 3.3 蜡梅花不同发育时期的CDNA-SRAP扩增差异显示
• 3.4 差异条带的测序及生物信息学分析
• 4 讨论
• 4.1 几个同源蛋白的功能分析与预测
• 4.2. 其他相关序列的功能分析与预测
• 参考文献
• 致谢