奶山羊乳腺发育的形态学研究

论文摘要

乳腺是一个具有重要经济价值的器官,其生长发育和泌乳生理功能密切相关。目前,世界上仅有少数实验室致力于乳腺基础研究。尽管有关哺乳动物乳腺发育和泌乳机制的研究开展地很早,但对于乳腺基础研究,尤其是奶山羊乳腺不同发育时期的相关形态学研究甚少。本研究应用激光扫描共聚焦显微技术、透射电镜技术、组织化学相关方法和Real-time PCR系统研究关中奶山羊乳腺组织发育不同时期的显微和超微结构改变,以及乳腺主要组织成分的变化情况,为进一步研究奶山羊乳腺的发育及功能提供翔实的形态学资料。本研究采用HE染色和透射电镜超薄切片法系统研究奶山羊乳腺组织胚后发育过程的显微和超微结构。结果表明:奶山羊乳腺发育是一个连续的过程,分为青春期、妊娠期、泌乳期和退化期四个阶段,其发育过程中的形态学、组织学和细胞生物学上的变化与其他反刍动物基本类似,与啮齿类动物存在一定差异。为了在表达和转录两个水平上系统阐述奶山羊乳腺中糖类、脂类和蛋白质的变化规律,分别应用过碘酸-Schiff、油红O、茚三酮-Schiff染色法检测奶山羊乳腺、并用直接免疫荧光法显示乳腺中β-酪蛋白的变化,同时对奶山羊乳腺发育中相关基因的表达变化做了相对定量分析。结果表明:（1）青春期、妊娠初中期和退化期乳腺中的糖类以糖蛋白和蛋白聚糖为主,妊娠晚期和泌乳期以乳糖为主。此外,乳糖合成关键酶-β-1,4-半乳糖基转移酶的表达与乳糖表达变化趋势基本一致,即在青春期和妊娠初期低水平表达,妊娠中期后逐渐增加,到泌乳期达到最高,退化期迅速下降,逐渐恢复到青春期的水平;（2）青春期乳腺主要为寓含三酰甘油的脂肪组织,脂代谢关键酶—乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）和激素敏感脂肪酶（HSL）表达水平很高,表明此时脂代谢非常旺盛。妊娠期和泌乳期,乳腺上皮细胞逐渐早现分泌特性,乳汁的生成需要乳脂大量合成,导致ACACA在妊娠期后持续升高,至泌乳中晚期达到顶峰,此外大脂肪细胞逐渐消失,腺泡上皮细胞内出现大量脂滴。HSL进入妊娠期后表达水平迅速下降,并在整个泌乳期持续低水平表达,既在一定程度上启动脂肪动员,又保证乳腺的结构脂不被降解,维持乳腺结构的完整性;退化期,腺体内脂滴开始相互融合成大的空泡状脂肪细胞,重新呈现性成熟未妊娠状态,此时ACACA和HSL表达水平均较低;（3）青春期、妊娠初期和退化期乳腺中的蛋白质以糖蛋白和蛋白聚糖等结合蛋向为主;妊娠中晚期和泌乳期以乳蛋白为主。（4）奶山羊乳腺发育过程中,β-酪蛋白出现在妊娠中期,表达水平逐渐升高,至泌乳期达到最高,退化期逐渐下降,妊娠晚期β-酪蛋白大量蓄积在腺泡上皮细胞内而不分泌到腺泡腔中,可能与其微团分泌方式有关;β-酪蛋白基因表达水平在青春期很低,到妊娠期迅速升高,整个泌乳期β-酪蛋白表达水平比较平稳,各时点无著异,而其基因表达水平却有显著差异,可见乳腺中β-酪蛋白的表达调控可能涉及多种调节因素的参与:退化早期β-酪蛋白及其基因表达水平开始逐渐下降,但仍显著高于青春期,可能是为下一次妊娠做准备,更快进入分泌表达状态。此外,本研究采用活细胞荧光标记法结合激光共聚焦显微技术,在亚细胞水平观察奶山羊乳腺发育中的结构变化。结果显示:奶山羊乳腺发育中,腺上皮细胞中内质网和线粒体的变化规律与乳腺组织超微结构利乳成分组化检测结果基本相符。退化期乳腺上皮细胞内仍维持一定数量的细胞器,可能是维持细胞正常机能和活动所必需的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 乳腺胚后发育的解剖学与组织学
• 1.1.1 乳房的大体解剖学
• 1.1.2 乳腺的组织学发育
• 1.1.3 乳腺的细胞学发育
• 1.2 乳腺的泌乳生物学
• 1.2.1 乳腺的泌乳过程
• 1.2.2 乳的生物化学
• 1.3 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 奶山羊乳腺组织发育不同时期的显微和超微结构
• 2.1.1 奶山羊乳腺组织发育不同时期的显微结构
• 2.1.2 奶山羊乳腺组织发育不同时期的超微结构
• 2.2 奶山羊乳腺组织发育不同时期糖类、脂类和蛋白质的变化
• 2.2.1 实验动物与样品采集
• 2.2.2 主要仪器设备及试剂
• 2.2.3 实验方法
• 2.3 奶山羊不同发育时期乳腺上皮细胞亚细胞结构的变化
• 2.3.1 实验动物与样品采集
• 2.3.2 主要仪器设备
• 2.3.3 奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养
• 2.3.4 奶山羊乳腺上皮细胞主要细胞器的检测
• 2.4 奶山羊乳腺组织发育不同时期相关基因的变化
• 2.4.1 实验动物与样品采集
• 2.4.2 主要仪器设备及试剂
• 2.4.3 实验方法
• 3 结果
• 3.1 奶山羊乳腺组织发育不同时期的显微和超微结构
• 3.1.1 奶山羊乳腺组织发育不同时期的显微结构
• 3.1.2 奶山羊乳腺组织发育不同时期的超微结构
• 3.2 奶山羊乳腺组织发育不同时期糖类、脂类和蛋白质的变化
• 3.2.1 过碘酸-Schiff反应（PAS）显示乳腺中糖类的变化
• 3.2.2 油红O染色法显示乳腺中脂类的变化
• 3.2.3 茚三酮-Schiff反应显示乳腺中蛋白质的变化
• 3.2.4 直接免疫荧光法显示β-酪蛋白的变化
• 3.3 奶山羊不同发育时期乳腺上皮细胞亚细胞结构的变化
• 3.3.1 奶山羊乳腺上皮细胞主要细胞器的检测
• 3.3.2 奶山羊乳腺上皮细胞主要细胞器的变化
• 3.4 奶山羊乳腺织织发育不同时期相关基因的变化
• 3.4.1 乳腺组织总 RNA提取
• 3.4.2 Real-time PCR
• 4 讨论
• 4.1 奶山羊乳腺组织发育不同时期的显微和超微结构
• 4.1.1 青春期乳腺组织结构
• 4.1.2 妊娠期乳腺织织结构
• 4.1.3 泌乳期乳腺织织结构
• 4.1.4 退化期乳腺组织结构
• 4.2 奶山羊乳腺组织发育不同时期糖类、脂类和蛋白质的变化
• 4.2.1 奶山羊乳腺中糖类的变化
• 4.2.2 奶山羊乳腺中脂类的变化
• 4.2.3 奶山羊乳腺中蛋白质的变化
• 4.2.4 β-酪蛋白的变化
• 4.3 奶山羊不同发育时期乳腺上皮细胞亚细胞结构的变化
• 4.3.1 乳腺上皮细胞主要细胞器与乳合成
• 4.3.2 乳腺上皮细胞主要细胞器的变化
• 4.4 奶山羊乳腺组织发育不同时期相关基因的变化
• 4.4.1 乳腺中脂代谢关键酶基因表达
• 4.4.2 乳腺中乳糖合成关键酶基因表达
• 4.4.3 乳腺中β-酪蛋白基因表达
• 4.5 本论文创新点
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文