新型猪瘟黏膜疫苗及检测试剂盒的研究

论文摘要

猪瘟（Hog Cholera, HC）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV;又称Hog cholera virus,HCV）引起的猪的急性高度接触性传染病,对养猪业危害极大。虽然随着许多综合防治措施的实施,已控制了猪瘟的大规模流行,但该病仍在我国广大养猪地区不断发生和小规模流行,每年均使养猪业蒙受巨大的经济损失。我国每年有3%的饲养猪死于猪瘟,其中90%是仔猪。并且近年来,该病在美洲、亚洲、欧洲等国家和地区呈现广泛流行的趋势,一些宣布已消灭了猪瘟的国家如法国、荷兰、德国、比利时等又见猪瘟复发的报道。研制更为有效的猪瘟疫苗和治疗药物已成为养猪业的迫切需要。E2（gp55）蛋白是CSFV病毒主要的抗原蛋白,也是三个病毒糖蛋白（E0、E1、E2）中保守性最低,最易变异的分子。实验证明,E2蛋白在体内可诱导产生病毒的中和抗体并激发对CSFV的免疫保护,使猪能够抵抗致死量CSFV的攻击。E2蛋白作为CSFV囊膜糖蛋白中最重要的一个保护性抗原蛋白,一直是国内外学者的主要研究对象。本研究结合LTB的粘膜免疫佐剂特性,选择了猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的部分保守抗原决定簇以及公认的有效粘膜免疫佐剂——大肠杆菌肠毒素B亚单位（LTB）的基因作为研究对象,参考毕赤酵母的密码子偏好性,人工合成了编码E2蛋白保守抗原决定簇和编码LTB的融合蛋白（E2-LTB）的编码基因。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体ppicZαa上,构建了重组表达载体ppicZaAE2-LTB,通过电转化使ppicZaA E2-LTB稳定整合到了P. pastoris宿主菌GS115中,成功构建了分泌表达工程菌ppicZaA E2-LTB/ GS115,诱导表达实验结果表明,目的蛋白E2-LTB能被毕赤酵母分泌到细胞外,通过western-blot分析表明该表达产物能与CSFV抗血清以及兔抗LTB血清反应,融合蛋白能与神经节苷脂受体结合,说明该融合蛋白具有良好的抗原性和生物学活性。在此基础上我们进一步对所构建融合蛋白酵母表达工程菌pPICαA-E2-LTB/ GS115的发酵参数进行了优化,以摇瓶培养方式探讨不同pH值,不同甲醇浓度,不同诱导时机以及不同诱导时间对外源蛋白表达的影响;以NBS BIOFLO 4500型30L发酵罐进行高密度发酵条件探索;利用硫酸铵分级分离、液相色谱对目的蛋白进行纯化。结果表明在pH=6.0的条件下以1%甲醇诱导表达96小时后,目的蛋白E2-LTB表达最优;在高密度发酵条件下,目的蛋白的理论表达量可以达到约1g/L,最终收率能够达到400mg/L发酵液,蛋白最终纯度达到95%以上。利用pPICαA-E2-LTB/ GS115工程菌分泌表达并经过纯化的E2-LTB融合蛋白作为一种粘膜免疫疫苗,采用口服和鼻饲两种方式对小鼠进行接种免疫实验,通过ELISA检测抗体水平、细胞因子水平对免疫学效力进行评估。结果表明:鼻饲、口服免疫途径都能激发产生IgA和IgG抗体,其中鼻饲产生的抗体效价高于口服免疫。使用融合蛋白产生的抗体明显高于单独使用E2蛋白组;无论是在免疫小鼠的血清中,还是在体外培养的小鼠脾细胞中,鼻饲E2-LTB都能增强IL-2、IL-5和INF-γ的分泌。对E2-LTB免疫3次的家兔接种100MID50剂量猪瘟兔化弱毒（HCLV）进行的免疫攻毒保护试验表明,空白对照组无保护作用,E2蛋白免疫组具有一定的免疫保护作用,而E2-LTB融合蛋白免疫组则完全能够抵抗猪瘟病毒的攻击。说明该黏膜免疫疫苗对实验动物具有良好的病毒保护能力。以纯化的E2蛋白为抗原包被酶标板,通过对ELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件:重组E2蛋白的最佳包被浓度为2.5ug/ml,最适包被条件为4℃24h,封闭液为加入0.02%硫柳汞、2mMEDTA、1%BSA,PBS,最佳封闭条件为37℃1h;最佳血清稀释倍数为100倍,酶标兔抗猪IgG最适工作浓度为1:1200,用含有4%PEG 6000的稀释液稀释二抗,其最佳工作时间为20min。通过试剂盒的特异性和敏感性实验以及重复实验表明该试剂盒具有特异性好,敏感性高,稳定性强等特点,其阴阳性值临界点OD值为0.15,对60份检测样品检验结果表明与进口试剂盒符合率达到83.3%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章：文献综述
• 第一节：猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2及其相关疫苗研究进展
• 一、猪瘟病毒的分子结构
• 1.1 猪瘟病毒的基因结构
• 1.2 猪瘟病毒的编码蛋白及其功能
• 1.3 CSFV的机体免疫防御机制
• 二、猪瘟病毒的检测
• 2.1 猪瘟病毒的血清学检测方法
• 2.2 猪瘟病毒的分子检测方法
• 三、猪瘟疫苗的研究进展
• 3.1 基因工程亚单位疫苗
• 3.2 病毒活载体疫苗
• 3.3 DNA疫苗
• 3.4 多肽疫苗
• 3.5 猪瘟病毒标记疫苗
• 第二节：大肠杆菌肠毒素B亚单位（LTB）研究进展
• 第三节：毕赤酵母表达系统研究进展
• 一、生物学特性
• 二、遗传征学特
• 三、外源蛋白的表达
• 3.1 表达载体
• 3.2 载体的整合
• 3.3 常见表达菌株
• 3.4 胞内表达与分泌表达
• 3.5 外源蛋白的糖基化
• 3.6 外源基因表达影响因素
• 四、毕赤酵母的高密度发酵
• 4.1 培养基
• 4.2 温度
• 4.3 PH值
• 4.4 溶解氧
• 4.5 甲醇的流加方式
• 4.6 防止外源蛋白的水解
• 第二章：新型猪瘟黏膜疫苗的研制
• 第一节： E2抗原决定簇与LTB基因的克隆及在酵母系统中的分泌表达
• 一、材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 二、实验结果
• 2.1 Ppicz aA E2-LTB 酶切鉴定
• 2.2 序列分析
• 2.3 重组子的筛选
• 2.4 SDS－PAGE 分析
• 2.5 Western blot检测
• 2.6 神经节苷脂受体ELISA
• 三、讨论
• 第二节 毕赤酵母表达E2-LTB 融合蛋白条件优化及纯化
• 一、实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 主要仪器
• 二、实验方法
• 2.1 不同pH 值对工程菌生长和外源蛋白表达的影响
• 2.2 不同诱导时机对外源蛋白表达的影响
• 2.3 不同诱导强度对外源蛋白表达的影响
• 2.4 不同诱导时间对外源蛋白表达的影响
• 2.5 工程菌的高密度发酵
• 2.6 E2 蛋白分离纯化
• 2.7 蛋白含量和纯度鉴定
• 三、实验结果
• 3.1 摇瓶培养中对E2-LTB-酵母工程菌生长和表达条件优化
• 3.2 高密度发酵
• 3.3 目的蛋白纯化
• 四、讨论
• 第三节 新型猪瘟黏膜疫苗对小鼠的免疫效力分析及兔体免疫保护研究
• 一、 材料和方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 粘膜疫苗
• 1.3 动物免疫
• 1.4 小鼠样品采集
• 1.5 小鼠抗体检测
• 1.6 小鼠细胞因子检测
• 1.7 兔体免疫攻毒保护试验
• 二、 实验结果
• 2.1 血清、鼻冲洗物和肺冲洗物中的IgG 抗体
• 2.2 血清、鼻冲洗物和肺冲洗物中的IgA 抗体
• 2.3 E2-LTB 诱导的细胞因子反应
• 2.4 兔体免疫攻毒保护试验结果
• 三、讨论
• 第三章 猪瘟抗体监测ELISA 试剂盒的研制
• 一、材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 二结果
• 2.1 目的蛋白浓度的确定
• 2.2 ELISA 试剂盒组合条件的优化
• 2.3 间接ELISA 方法阴阳性值的确定
• 2.4 与IDEXX 公司试剂盒的比较（表5）
• 2.5 试剂盒的重复性试验
• 2.6 试剂盒特异性和敏感性试验
• 2.7 试剂盒的保存及稳定性试验
• 三、讨论
• 参考文献
• 致谢