Tau蛋白的PKA磷酸化位点突变体对其磷酸化的影响

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种最常见的神经退行性疾病,神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT）和老年斑（senile plaque）为其主要病理特征,神经原纤维缠结的数量与病人认知功能严重程度密切相关。构成NFT的主要成分是异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau。Tau蛋白的主要功能是促进微管组装,维持微管稳定性,维持神经元细胞内的轴突运输。当tau蛋白被异常过度磷酸化,并在细胞内形成了聚积后,导致tau蛋白功能异常,引起微管解聚,最后促使神经元发生退行性变。Tau蛋白的磷酸化水平受多种激酶的调节,尤其是PKA和GSK-3β,在tau蛋白的磷酸化过程中起着重要作用。激酶活性上调是导致tau蛋白异常过度磷酸化的重要原因。已有研究报道,Tau的过度磷酸化可能是多种激酶联合作用的结果,tau的某些位点被一种激酶磷酸化后,可以促进或抑制其他激酶对tau蛋白磷酸化位点的磷酸化,如动物整体和体外试验表明,PKA对tau蛋白某些位点的预磷酸化可促进GSK-3β对tau的磷酸化作用,在GSK-3β活性不明显增加的情况下,能促使tau蛋白过度磷酸化,其具体作用机制尚不清楚。为了探讨tau的PKA磷酸化位点是如何影响tau蛋白生物学功能,从而阐明体内PKA与GSK-3β共同调节tau蛋白的磷酸化的机制。我们构建了含不同PKA磷酸化位点突变的tau原核与真核表达重组体,用真核载体在细胞水平,探讨tau蛋白PKA磷酸化位点预磷酸化如何改变tau的底物特性、聚积性质和生物学功能等。本实验分别在HEK293/wt细胞和N2a/wt细胞上瞬时转染不同重组tau的真核表达载体,再用PKA特异性激活剂forskolin,以及forskolin与GSK-3β特异性抑制剂SB联合处理,以确定是GSK-3β的作用,最后分别用免疫印迹技术和免疫荧光技术检测tau蛋白的磷酸化状态及其分布聚集状态。结果显示:Forskolin可以通过激活PKA,使tau蛋白PKA磷酸化位点磷酸化但不能使其突变位点磷酸化;当tau蛋白409位点的丝氨酸突变为丙氨酸时,Ser262位点的磷酸化程度减弱,Ser404位点没有被磷酸化;Tau蛋白409位点的丝氨酸突变为谷氨酸时,Ser262位点的磷酸化程度增强,而Ser404位点依旧没有被磷酸化; TauS214A、tauS262A、tauS409A与tauS409E蛋白较tauWT蛋白的Thr231位点的磷酸化状态均有不同程度的减弱;TauWT在forskolin作用下其Ser396/404（PHF-1检测的位点）的磷酸化程度增加了,而tauS214A、tauS262A及tauS409A在forskolin处理后Ser396/404位点的磷酸化程度均降低了,在forskolin+SB联合作用下Ser396/404位点几乎不能被磷酸化。以上研究结果表明:1. Ser409位点的磷酸化可以使tauSer262位点更易被相应的激酶磷酸化,并且Ser409突变使Ser404位点不易被磷酸化。2. tau蛋白的Ser214位点的磷酸化可以促进Thr231位点的磷酸化;3. PKA分别预磷酸化tau蛋白的Ser262/409位点,均可以增强GSK-3β对Ser396/404位点的磷酸化作用,使其磷酸化水平明显增高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 创新点
• 参考文献
• 综述
• 致谢