假单胞菌表达载体的构建及金属硫蛋白的表面展示

论文摘要

本研究利用恶臭假单胞菌AB92019的oprL基因启动子构建了一个假单胞菌表达载体,并采用绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因对该载体的表达性能和在受体菌中的稳定性进行了考察;在此基础上,以冰核活性蛋白N-结构域为运载蛋白,采用C-端融合的方法,分别将绿色荧光蛋白和金属硫蛋白成功展示在恶臭假单胞菌AB92019菌株的细胞表面,并分别对重组菌株展示GFP的性能及其对Cd2+、Cu2+、Mn2+等几种重金属离子的全细胞吸附性能进行了测定。将PCR扩增得到的恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL片断和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCP18的EcoR I/HindⅢ位点,获得了重组表达载体pYMB03。用gfp作为标记基因进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5α菌株中由PoprL启动组成型表达GFP蛋白,并使细胞产生可见荧光。经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.0%。重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值622.33,但与培养温度未见相关性。对携带该载体的重组恶臭假单胞菌7次168h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%。在构建的恶臭假单胞菌表达载体pYMB03的oprL启动子下游,通过插入冰核活性蛋白N-末端结构基因（inaK-n）,构建了以冰核活性蛋白N-端结构域作为锚定模体的恶臭假单胞菌表面展示载体pYN,然后将gfp基因编码区插入展示载体pYN得到融合基因inaK-n/gfp,将重组质粒电转化导入恶臭假单胞菌AB92019菌株,构建得到恶臭假单胞菌表面展示重组菌YN-P。对重组菌YN-P进行了细胞组分的分级分离,测定了细胞质、细胞内膜以及细胞外膜这三个组分的荧光强度,并经Western-blot证实融合蛋白InaK-N/GFP成功定位在恶臭假单胞菌受体菌细胞外膜。利用所构建的假单胞菌细胞表面展示载体,选择具有重金属吸附特性的金属硫蛋白作为乘客蛋白,进一步构建了含融合基因inaK-n/smtA、inaK-n/（smtA）2、inaK-n/（smtA）3和inaK-n/（smtA）4的系列重组质粒pYNS、pYN2S、pYN3S和pYN4S,经电转化恶臭假单胞菌AB92019后,分别得到相应的重组菌株YN-S、YN-2S,YN-3S和YN-4S。将这四株重组菌株分别在16℃、20℃、24℃、28℃和37℃下培养,进而考察了他们对Cd2+、Cu2+、Mn2+三种重金属离子的吸附性能。结果表明,表面展示2个串连拷贝金属硫蛋白的重组菌YN-2S在24℃培养24 h后对这三个重金属的吸附效果最优,每毫克干重菌体的全细胞吸附量分别达到62.10±6.70 nmol Cd2+、71.54±5.98 nmol Cu2+和89.86±1.05 nmol Mn2+。将重组菌YN、YN-S和YN-2S置于含有高浓度Cd2+、Cu2+和Mn2+三种重金属离子的溶液环境中,考察其耐受性,结果显示,重组菌耐重金属性能均强于出发菌株,其中以重组菌YN-2S的耐受能力最强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 微生物细胞表面展示技术研究进展
• 1.1.1 微生物细胞表面展示技术简介
• 1.1.2 运载蛋白
• 1.1.3 乘客蛋白
• 1.1.4 微生物细胞表面展示体系的种类
• -细菌表面展示体系'>1.1.4.1 G^-细菌表面展示体系
• +细菌表面展示体系'>1.1.4.2 G⁺细菌表面展示体系
• 1.1.4.3 酵母菌表面展示体系
• 1.1.5 微生物细胞表面展示技术的应用现状
• 1.1.5.1 开发重组的活细胞疫苗
• 1.1.5.2 多肽文库的表面展示和筛选
• 1.1.5.3 全细胞催化剂
• 1.1.5.4 全细胞吸附剂
• 1.2 利用假单胞菌冰核蛋白作为运载蛋白的细胞表面展示体系
• 1.2.1 冰核活性蛋白（Ice Nucleation Protein）
• 1.2.2 已克隆的冰核蛋白基因
• 1.2.3 冰核蛋白在细胞表面展示方面的应用
• 1.2.3.1 抗原或抗体的表面展示
• 1.2.3.2 工业酶类展示
• 1.2.3.3 多肽文库的筛选
• 1.2.3.4 重金属螯合剂展示
• 1.3 金属硫蛋白研究进展
• 1.3.1 金属硫蛋白简介
• 1.3.2 金属硫蛋白的种类
• 1.3.2.1 真核细胞金属硫蛋白
• 1.3.2.2 原核细胞金属硫蛋白
• 1.3.3 金属硫蛋白的应用现状
• 1.4 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 PCR反应的引物
• 2.1.5 试剂和仪器
• 2.1.5.1 质粒和总DNA提取、质粒转化时所用到的试剂
• 2.1.5.2 琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE电泳所需试剂
• 2.1.5.3 Western-blot所用试剂
• 2.1.5.4 GFP荧光强度检测所需试剂
• 2.1.5.5 重金属吸附实验所需试剂
• 2.1.5.6 酶切、酶连、PCR和DNA回收所需试剂
• 2.1.5.7 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌和恶臭假单胞菌质粒DNA的提取
• 2.2.2 恶臭假单胞菌的总DNA的提取
• 2.2.3 DNA电泳分析
• 2.2.4 DNA片断的回收
• 2.2.5 PCR扩增
• 2.2.6 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.7 恶臭假单胞菌的电转化
• 2.2.8 绿色荧光蛋白（GFP）荧光强度的检测
• 2.2.9 SDS-PAGE电泳以及Western-blot分析
• 2.2.9.1 菌体总蛋白的样品制备
• 2.2.9.2 SDS-PAGE凝胶的制备
• 2.2.9.3 电泳、染色及脱色
• 2.2.9.4 Western-blot分析
• 2.2.10 质粒稳定性分析
• 2.2.11 恶臭假单胞菌细胞分级分离
• 2.2.12 重金属吸附实验
• 3 结果与分析
• 3.1 恶臭假单胞菌表达载体的构建及功能鉴定
• 3.1.1 大肠杆菌—假单胞菌穿梭表达载体pYMB03质粒的构建
• 3.1.2 重组质粒pYMBP的构建
• 3.1.3 pYMBP质粒电转化入恶臭假单胞菌AB92019
• 3.1.4 表达载体pYMB03的表达性能及其分析
• 3.1.4.1 在恶臭假单胞菌中的表达及其影响因素
• 3.1.4.2 表达载体pYMB03在恶臭假单胞菌中的稳定性
• 3.1.4.3 在大肠杆菌中的表达
• 3.2 恶臭假单胞菌表面展示载体的构建及功能鉴定
• 3.2.1 含融合基因inaK-n/gfp的重组质粒pYNP的构建
• 3.2.2 pYNP质粒电转化入恶臭假单胞菌AB92019
• 3.2.3 融合蛋白InaK-N/GFP在重组菌的表达及表面活性
• 3.2.3.1 融合蛋白InaK-N/GFP在重组菌的表达性能
• 3.2.3.2 融合蛋白InaK-N/GFP在重组菌的表面活性测定
• 3.3 金属硫蛋白的表面展示
• 3.3.1 串连多拷贝smtA基因的表面展示载体的构建
• 3.3.2 重组质粒电转化恶臭假单胞菌AB92019
• 3.3.3 融合蛋白InaK-N/（SMTA）n在重组菌的表面表达
• 3.3.4 重组菌对游离重金属的吸附试验
• 3.3.5 重组菌对游离重金属的耐受性试验
• 4 小结和讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢