乳腺癌WWOX基因CpG岛甲基化和肼苯哒嗪去甲基化的实验研究

论文摘要

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤,抑癌基因和癌基因的异常表达是乳腺癌发生的重要机制。WWOX（WW domain containing oxidoreductase）基因是跨越了整个常见染色体脆性位点FRA16D的一个新的抑癌基因,2000年由Bednarek等应用鸟枪基因测序技术结合对感兴趣对应的转录子进行分离并分析的方法鉴定出的一个新基因,位于染色体16q23.3-24.1。研究发现,多种癌细胞中出现WWOX外显子5-8或6-8的异常转录,提示WWOX是另一种具抑制肿瘤生长的基因,在基因组和转录水平影响这个基因的异常可能与致癌性有关。研究发现在乳腺癌、卵巢癌和非小细胞性肺癌中存在着WWOX的表达降低,WWOX基因在多种肿瘤组织及细胞系中出现频发杂合性丢失、mRNA异常转录子及WWOX蛋白表达异常等证明WWOX属于抑癌基因。WWOX蛋白含有414个氨基酸,其氨基末端有两个WW结构域,而WW结构域的功能主要与蛋白之间的相互作用有关。在WWOX蛋白的中心部位有一短链氧化还原酶功能域（short-chain dehydrogenase/reductase domain,SRD）,SRD具有特异性酶的功能。因此,WWOX可能在雌二醇和雌激素受体相互作用的调节中发挥了作用。抑癌基因在基因组和转录水平的异常表达是肿瘤发生的常见原因,WWOX基因失活机制可能有:①WWOX等位基因杂合子缺失及纯合子缺失;②WWOX基因mRNA转录缺失或严重降低,导致表达缺失或降低;③DNA调控区CpG岛甲基化。WWOX基因与脆性三联组氨酸（FHIT）基因的mRNA表达有相关性。文献报道胰腺癌中WWOX基因的表达缺失与DNA调控区CpG岛的甲基化有关。近年来肿瘤基因甲基化的研究之所以受到肿瘤研究者的重视,原因在于:（1）基因调控区域的CpG岛的甲基化与各种基因（包括抑癌基因）表达的调控异常密切相关;（2）特异性CpG岛的甲基化容易在癌症患者个体以及高危人群的体液和组织中检测到,因此特异性基因甲基化模式的研究有助于肿瘤诊断和预后预测;（3）甲基化可以被特异性抑制剂所逆转,提示这一类型的抑制剂可以应用于临床治疗。研究发现肼苯哒嗪能作为去甲基化药物恢复T淋巴细胞功能相关抗原、诱导出P16基因启动子甲基化的乳腺癌细胞系的P16基因mRNA和蛋白质表达,在肿瘤治疗中显示出良好的应用前景。本研究目的:①通过检测乳腺癌和癌旁乳腺组织中WWOX蛋白的表达,并与ER、PR、HER-2/neu、绝经状态及临床分期等临床病理学指标进行分析;通过逆转录酶联聚合反应（RT-PCR）检测乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞系以及乳腺癌标本WWOX基因mRNA的表达;②应用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）检测乳腺癌中WWOX基因表达异常与DNA调控区（启动子及第一外显子）CpG岛甲基化状态的关系;③应用肼苯哒嗪对MDA-MB-231、MCF-7细胞进行处理,以5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR）作为阳性对照,观察肼苯哒嗪对于WWOX基因CpG岛去甲基化、mRNA表达及癌细胞增殖活性的作用。现将主要内容简要介绍如下。第一部分乳腺癌WWOX蛋白表达及其临床意义目的检测乳腺癌组织及细胞株中WWOX蛋白表达,并分析其与ER、绝经状态及临床分期等指标间的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测56例乳腺正常组织、12例DCIS和87例乳腺癌组织WWOX蛋白的表达,并与雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、HER-2/neu、绝经状态及肿瘤分期等临床病理学资料进行分析。应用免疫细胞化学法检测MDA-MB-231、MCF-7细胞中WWOX蛋白的表达。结果1.乳腺癌组织中WWOX蛋白表达显著降低（62.1%）,与乳腺正常组织（28.6%）相比,差异有统计学意义（P=0.001）;2.乳腺癌组织WWOX表达缺失与ER状态关系密切,39.2%的ER阴性病例和28.8%的ER阳性病例中WWOX蛋白表达缺失,差异有统计学意义（P=0.026）;3.乳腺癌WWOX蛋白表达与绝经状态相关,20.3%的绝经前病人和57.2%的绝经后病人中WWOX蛋白表达缺失,差异有统计学意义（P=0.003）;4.晚期乳腺癌病人WWOX表达降低或缺失的比例增高,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期病人中WWOX蛋白表达缺失的比例分别为23.1%、28.6%和46.2%,差异有统计学意义（P=0.001）;5.MDA-MB-231细胞WWOX蛋白染色明显降低,而MCF-7细胞呈现强染色;6.WWOX蛋白表达与PR、HER-2/neu及腋窝淋巴结转移等指标的关系无统计学意义（P＞0.05）。结论乳腺癌中广泛存在着WWOX蛋白的表达缺失,其异常表达与ER状态、绝经状态和肿瘤临床分期关系密切,提示WWOX基因可能通过激素受体信号途径在乳腺癌的发生和发展中发挥作用。乳腺癌MDA-MB-231细胞WWOX蛋白低表达,而MCF-7细胞高表达。第二部分乳腺癌组织和细胞株WWOX基因调控区（启动子和第一外显子）CpG岛甲基化状态的研究目的探讨乳腺癌组织和MDA-MB-231、MCF-7细胞株中WWOX基因调控区（启动子和第一外显子）CpG岛甲基化状态,并分析WWOX基因mRNA表达与CpG岛甲基化状态的关系。方法选取乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7细胞、20例乳腺癌组织和10例癌旁组织为研究对象,通过WWOX基因DNA提取,应用CpGenomeDNA修正盒进行DNA亚硝酸盐修饰,采用甲基化特异性PCR（methylation specificPCR,MSP）方法检测乳腺癌组织和细胞系WWOX基因CpG岛甲基化状态;通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测WWOX基因mRNA表达,探讨WWOX基因CpG岛甲基化与mRNA表达的关系。结果1.乳腺癌癌旁组织中WWOX基因DNA调控区CpG岛无甲基化条带表达;2.20例乳腺癌组织中,11例中出现WWOX基因启动子CpG岛甲基化扩增,甲基化率为55%,其中4例为完全甲基化（仅甲基化引物扩增出目的基因）,7例为部分甲基化（甲基化引物和非甲基化引物均扩增出目的基因）。9例中出现WWOX基因第一外显子CpG岛甲基化扩增,甲基化率为45%,其中4例为完全甲基化,5例为部分甲基化;3.乳腺癌组织和癌旁组织中WWOX基因mRNA相对含量的平均值分别为1.18±0.11、2.1±0.12,差异有统计学意义（P＜0.05）;4.WWOX基因调控区CpG岛甲基化的乳腺癌组织中WWOX mRNA表达显著降低,与癌旁组织相比,差异有统计学意义（P＜0.001）;5.WWOX基因调控区CpG岛甲基化与非甲基化的乳腺癌组织中mRNA表达水平分别为0.62±0.08、1.81±0.21,差异有统计学意义（P＜0.01）;6.MDA-MB-231细胞WWOX基因启动子、第一外显子CpG岛MSP扩增出阳性条带,而非甲基化PCR扩增阴性;MBA-MD-231细胞中,WWOX mRNA表达显著降低（0.03±0.02）;7.MCF-7细胞未出现WWOX基因CpG岛甲基化阳性条带,而非甲基化扩增阳性。WWOX mRNA高表达（1.52±0.14）。结论乳腺癌组织和细胞系存在着不同程度的WWOX基因DNA调控区（启动子和外显子）CpG岛甲基化,是导致WWOX基因表达缺陷的原因之一。WWOX基因调控区CpG岛甲基化的乳腺癌组织WWOX mRNA表达明显降低,提示DNA甲基化是乳腺癌WWOX基因mRNA表达缺陷的重要机制。第三部分肼苯哒嗪对乳腺癌细胞WWOX基因CpG岛去甲基化作用的实验研究目的探讨肼苯哒嗪能否发挥去甲基化作用,诱导乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞mRNA及蛋白表达,并抑制细胞增殖。方法肼苯哒嗪处理MDA-MB-231、MCF-7细胞,以5-Aza-CdR作为阳性对照,MSP检测WWOX基因CpG甲基化状态;RT-PCR分析药物处理组、对照组WWOX基因mRNA及蛋白表达变化;采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,噻唑蓝（MTT）法测定细胞抑制率,分析肼苯哒嗪处理前后乳腺癌细胞的生长变化。结果1.MDA-MB-231细胞WWOX基因启动子、第一外显子甲基化PCR扩增阳性,非甲基化PCR扩增阴性;经10μmol/L肼苯哒嗪处理后,MDA-MB-231细胞WWOX基因MSP不能扩增出阳性条带,而非甲基化扩增阳性;WWOX基因mRNA表达明显高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.001）;WWOX蛋白表达增强;细胞的增殖速度减慢,对数生长期均延迟24h,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.001）2.1.0,2.0,4.0,6.0μmol/L浓度的5-Aza-CdR处理后,WWOX基因MSP亦不能扩增出阳性条带,非甲基化扩增阳性;不同浓度5-Aza-CdR处理后,MDA-MB-细胞WWOX基因mRNA表达明显升高,但WWOX mRNA表达相对值与5-Aza-CdR的浓度无相关关系;细胞的增殖速度减慢,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.001）。3.肼苯哒嗪及5-Aza-dc处理前后,MCF-7细胞WWOX基因启动子和第一外显子CpG岛非甲基化扩增阳性,无甲基化扩增;WWOX mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）;细胞生长无显著性差异（P＞0.05）。结论肼苯哒嗪可以发挥去甲基化作用,诱导MDA-MB-231细胞WWOX基因mRNA及蛋白表达,并抑制细胞增殖活性。1.0、2.0、4.0、6.0μmol/L等浓度的5-Aza-CdR处理MDA-MB-231细胞后,在去甲基化、恢复WWOX基因mRNA和蛋白表达以及降低癌细胞增殖等方面作用无显著性差异。乳腺癌中广泛存在着WWOX基因的表达缺失,其异常表达与ER状态、绝经状态和肿瘤临床分期关系密切,提示WWOX基因可能是通过激素受体信号途径在乳腺癌的发生和发展中发挥作用。乳腺癌组织中存在不同程度的WWOX基因启动子和第一外显子CpG岛的完全甲基化和部分甲基化,且WWOX基因mRNA表达降低,提示CpG岛甲基化是乳腺癌WWOX基因mRNA表达缺陷的重要机制。MDA-MB-231细胞中,WWOX基因启动子和第一外显子CpG存在着完全甲基化,WWOX基因mRNA及蛋白表达明显降低。MCF-7细胞无WWOX基因CpG岛甲基化,WWOX基因mRNA及蛋白高表达。10μmol/L肼苯哒嗪和1.0、2.0、4.0、6.0μmol/L的5-Aza-CdR对MDA-MB-231细胞可以起到去甲基化作用,处理后WWOX基因启动子和第一外显子CpG岛甲基化扩增条带消失,WWOX基因mRNA重新表达,WWOX蛋白染色显著增强,且细胞增殖活性明显降低。我们的研究证明DNA启动子和第一外显子CpG岛甲基化是WWOX基因表达缺失的重要机制,肼苯哒嗪可以恢复MDA-MB-231细胞WWOX基因mRNA表达并抑制细胞增殖,有望成为新的乳腺癌治疗方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 论文正文
• 前言
• 第一部分:乳腺癌组织和细胞系WWOX蛋白表达及其临床意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分:乳腺癌组织和细胞系WWOX基因调控区（启动子和第一外显子）CpG岛甲基化状态的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分:肼苯哒嗪对乳腺癌细胞WWOX基因CpG岛去甲基化作用的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表文章
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 英文论文