宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆、表达及定向诱变研究

论文摘要

木聚糖酶（EC 3.2.1.8）以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键,产生不同链长的寡糖和木糖,是木聚糖降解酶系中最关键的酶。它广泛存在于各种微生物中,在饲料、造纸、食品、医药以及能源工业中有着广阔的应用前景。根据宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001木聚糖酶（XynⅡ）N末端15个氨基酸残基序列以及真核生物mRNA在3′端存在poly（A）等序列信息,利用RACE技术扩增和克隆了相关的基因片段,获得了XynⅡ的全长cDNA序列和DNA序列,并分析了该序列的有关信息。克隆的cDNA序列、DNA序列的Genbank登录号分别为DQ114485和DQ191144。成熟肽基因推导的氨基酸序列同其他微生物来源的若干G/11族木聚糖酶相比,具有较高的同源性,属内比对,与来源于Aspergillus niger（GenBank登录号:ANU39784）的木聚糖酶同源性最高,达89%。将XynⅡ成熟肽的cDNA序列克隆至pET-28a（+）表达载体中,在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中进行了IPTG诱导表达,木聚糖酶的比酶活最高达49.61U/mg。进而将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115和KM71,经筛选获得阳性重组菌PXGL98（Mut+）和PXKL29（Muts）。该木聚糖酶基因在2种毕赤酵母中均实现了分泌表达,工程菌发酵条件优化后,PXGL98与PXKL29发酵液中的比酶活分别可达3139.68 U/mg和3846.83 U/mg。对木聚糖酶XynⅡ进行同源建模和序列比较,定向诱变证明在催化反应中起重要作用的氨基酸残基为Glu-79和Glu-170。研究发现第11族木聚糖酶的催化结构域在B折叠股A3和B3之间存在一个保守的氨基酸位点Asp-37,该位点与木聚糖酶的pH特性有关,据此设计了XynⅡ的D37N定向诱变。酶学性质分析显示,XynⅡD37N的最适pH值由4.2升高到5.3,pH稳定范围也向碱性方向偏移,由pH 3.0-7.5变为pH 3.0-9.0。这表明木聚糖酶XynⅡ的第37位Asp与最适pH值相关,为进一步的结构与功能研究提供了理论基础。在XynⅡ的“Ser/Thr”平面引入精氨酸的四点诱变（ST4）和五点诱变（ST5）,对酶的热稳定性进行改造。获得的两个突变酶在热稳定性上比野生型酶都有不同程度的提高。突变酶ST4和突变酶ST5使酶的最适温度分别由原酶的50℃提高为52℃和55℃。55℃保温15 min,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的20%提高为65%和75%;保温1h,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的15%提高为50%和65%。该突变酶在保持了XynⅡ优良性质的基础上,进一步提高了其热稳定性,具有更好的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 木聚糖的结构和木聚糖降解酶系统
• 1.3 木聚糖酶研究进展
• 1.3.1 木聚糖酶的类别
• 1.3.2 木聚糖酶的多样性
• 1.3.3 木聚糖酶的酶学性质
• 1.3.4 木聚糖酶的诱导和抑制机理
• 1.3.5 木聚糖酶的分子结构
• 1.3.6 木聚糖酶的分子催化机理
• 1.3.7 木聚糖酶基因的克隆和表达
• 1.3.8 木聚糖酶分子的进化
• 1.3.9 木聚糖酶基因的改造
• 1.3.10 木聚糖酶的应用
• 1.4 研究的内容、目的和意义
• 第二章 木聚糖酶基因xynⅡ的克隆和序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 化学试剂及试剂盒
• 2.2.3 溶液配制
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 PCR引物的设计与合成
• 2.2.6 培养基
• 2.2.7 XynⅡ的N端氨基酸序列测定
• 2.2.8 宇佐美曲霉总RNA提取
• 2.2.9 宇佐美曲霉总DNA的抽提
• 2.2.10 3'RACE法扩增XynⅡ cDNA部分序列
• 2.2.11 5'RACE法扩增XynⅡ cDNA部分序列
• 2.2.12 PCR扩增XynⅡ DNA序列
• 2.2.13 DNA电泳回收
• 2.2.14 PCR产物的TA克隆
• 2.2.15 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.16 大肠杆菌的转化
• 2.2.17 重组子的筛选
• 2.2.18 序列测定及序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 宇佐美曲霉总RNA提取
• 2.3.2 XynⅡ cDNA部分序列的3'RACE法扩增、克隆和测定
• 2.3.3 XynⅡ cDNA部分序列的5'RACE法扩增、克隆和测定
• 2.3.4 XynⅡ cDNA序列分析
• 2.3.5 XynⅡ DNA序列的PCR扩增、克隆和测定
• 2.3.6 XynⅡ DNA序列分析
• 2.3.7 宇佐美曲霉木聚糖酶XynⅡ与其它木聚糖酶一级结构的同源性比较
• 2.3.8 木聚糖酶XynⅡ的系统进化树分析
• 2.3.9 XynⅡ二级结构分析及三维结构建模
• 2.4 本章小结
• 第三章 木聚糖酶基因xynⅡ在大肠杆菌中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 生化试剂
• 3.2.3 溶液配制
• 3.2.4 培养基及培养条件
• 3.2.5 PCR引物的设计与合成
• 3.2.6 目的基因的扩增及大肠杆菌重组表达载体的构建
• 3.2.7 诱导产酶及粗酶提取方法
• 3.2.8 重组大肠杆菌表达产物的分析
• 3.2.9 大肠杆菌重组木聚糖酶的纯化
• 3.2.10 酶学性质的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 大肠杆菌表达载体的构建
• 3.3.2 不同表达载体在大肠杆菌中表达木聚糖酶
• 3.3.3 稀有密码子加富对重组木聚糖酶表达的影响
• 3.3.4 木聚糖酶在大肠杆菌中表达条件的优化
• 3.3.5 重组表达木聚糖酶的性质
• 3.4 本章小结
• 第四章 木聚糖酶基因xynⅡ在毕赤酵母中的分泌表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 酶及主要试剂
• 4.2.2 培养基及主要化学试剂的配制
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 菌株与质粒
• 4.2.5 目的基因的扩增及重组表达载体pPIC9K-xynⅡ的构建
• 4.2.6 重组表达质粒pPIC9K-xynⅡ的线性化及纯化
• 4.2.7 毕赤酵母GS115及KM71电转化感受态细胞的制备
• 4.2.8 酵母细胞的转化
• 4.2.9 采用G418浓度梯度培养基筛选毕赤酵母高拷贝转化子
• 4.2.10 毕赤酵母甲醇利用表型的鉴定
• 4.2.11 目的基因在毕赤酵母中的表达
• 4.2.12 重组毕赤酵母表达产物的分析
• 4.2.13 酵母分泌情况的确定
• 4.2.14 毕赤酵母总DNA提取
• 4.2.15 重组毕赤酵母的稳定性检测
• 4.2.16 重组木聚糖酶的纯化
• 4.2.17 重组木聚糖酶酶学性质的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 重组表达载体pPIC9K-xynⅡ的构建
• 4.3.2 重组表达质粒pPIC9K-xynⅡ的大量提取及线性化
• 4.3.3 酵母的电击转化与筛选
• 4.3.4 重组毕赤酵母的诱导产酶
• 4.3.5 重组毕赤酵母的遗传稳定性
• 4.3.6 毕赤酵母工程菌发酵条件的优化
• 4.3.7 毕赤酵母分泌情况的确定
• 4.3.8 SDS-PAGE分析
• 4.3.9 重组木聚糖酶的纯化
• 4.3.10 重组表达木聚糖酶的性质
• 4.3.11 酶学性质的比较与分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 木聚糖酶XynⅡ催化残基的研究及最适pH值的定向诱变
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 酶、培养基与主要试剂
• 5.2.2 菌株与质粒
• 5.2.3 催化残基及相关位点的确定
• 5.2.4 定向诱变方法
• *与pPIC9K-xynⅡB^*的构建'>5.2.5 重组表达载体pET-28a-xynⅡB^*与pPIC9K-xynⅡB^*的构建
• *在大肠杆菌中的表达'>5.2.6 突变酶基因xynⅡB^*在大肠杆菌中的表达
• *在毕赤酵母中的表达'>5.2.7 突变酶基因xynⅡB^*在毕赤酵母中的表达
• 5.2.8 突变木聚糖酶的纯化
• 5.2.9 突变木聚糖酶酶学性质的测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 催化残基及相关位点的确定
• 5.3.2 催化残基及相关位点的定向诱变
• *与pPIC9K-xynⅡB^*的构建'>5.3.3 重组表达质粒pET-28a-xynⅡB^*与pPIC9K-xynⅡB^*的构建
• 5.3.4 重组突变木聚糖酶的表达及纯化
• 5.3.5 酶学性质的比较与分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 木聚糖酶XynⅡ热稳定性的定向诱变研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 酶、培养基与主要试剂
• 6.2.2 菌株与质粒
• 6.2.3 影响热稳定性的残基位点的确定
• 6.2.4 定向诱变方法
• *的构建'>6.2.5 重组表达载体pPIC9K-xynⅡC^*的构建
• *在毕赤酵母中的表达'>6.2.6 突变酶基因xynⅡC^*在毕赤酵母中的表达
• 6.2.7 突变木聚糖酶的纯化
• 6.2.8 突变酶酶学性质的测定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 影响热稳定性的残基位点的确定
• 6.3.2 Arg引入"Ser/Thr"平面的定向诱变
• *的构建'>6.3.3 重组表达质粒pPIC9K-xynⅡC^*的构建
• 6.3.4 突变酶的表达及纯化
• 6.3.5 突变酶酶学性质的比较与分析
• 6.4 本章小结
• 论文结论与展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者在攻读博士学位期间发表的论文