酱油发酵过程微生物群落结构的动态研究

论文摘要

酱油是我国传统的酿造调味品，历史悠久，深受广大人们的喜爱。广东多数酱油生产企业采用传统的高盐稀醪发酵工艺，日晒夜露，发酵周期长，酿制的酱油色淡味鲜，酱香浓郁，风味好。酱油发酵过程中原油中的微生物区系对酱油的质量控制十分重要，但到目前为止还未见相关报道。酱油的生产涉及到多种微生物的协同作用，其中最重要的是乳酸菌和酵母菌，它们的主要作用是发酵产生小分子醇、醛、酸、酯、酚等成香、成味物质。本文通过对酱油发酵过程不同时期的样品的氨基态氮、总酸、NaCl含量、pH值检测研究，了解了酱油生产发酵周期内氨基态氮、总酸、NaCl含量、pH值随发酵时间的变化规律。采用16S rDNA PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术，以高盐稀醪发酵工艺生产的广东酱油为研究对象，研究了酱油发酵过程中微生物群落结构的多样性及动态变化。主要研究成果如下：1.研究了酱油生产发酵周期内氨基态氮、总酸、NaCl含量、pH值随发酵时间的变化规律。研究结果表明：发酵期间，前15天氨基酸态氮转化率特别高，含量很快接近0.8g/100mL；发酵15天之后，氨基态氮的含量增长缓慢，到发酵期结束，含量接近1.0g/100mL。发酵前15天，总酸含量骤增，pH值及NaCl含量稍微下降，发酵15天后，总酸含量、pH值及NaCl含量基本维持稳定。2.比较了细菌基因组DNA提取试剂盒和酱油类DNA提取试剂盒提取酱醅样品中细菌总DNA的效果，琼脂糖电泳图谱显示酱油类DNA提取试剂盒的提取效果更佳。3.探索优化了降落PCR的反应体系和反应程序，结果显示在PCR反应体系中最佳的DNA模板添加量为6μL，同时最适的起始退火温度为65℃时，能得到最佳的扩增效果。4.研究了上样量对DGGE电泳图谱效果的影响，确定最佳上样量为20μL；采用时间进程法确定了最佳电泳时间为3.5h。综合以上优化的试验参数，得到的DGGE电泳图谱，条带清晰，并且分离效果理想。5.对酱油发酵过程微生物多样性进行了分析。通过对不同发酵阶段样品的DGGE指纹图谱分析，选择18条特征条带进行割胶回收，并测序、Blast分析了条带的最相似细菌。结果表明，4条条带代表Weissella cibaria（魏斯菌属），5条条带代表不可培养微生物，分别为uncultured Firmicutes bacterium（不可培养厚壁菌），uncultured bacterium（不可培养细菌），uncultured bacterium（不可培养细菌），Uncultured Enterobacter sp.（不可培养肠杆菌），Uncultured Klebsiella sp.（不可培养克雷伯菌），其余条带代表Weissella paramesenteroides（类肠膜魏斯氏菌），Lactobacillus fermentum（发酵乳杆菌），Citrobacter freundii（弗氏柠檬酸杆菌），Enterobacter sp. BF1-8（肠杆菌属），Chromohalobacter sp.（色盐杆菌属），Pantoea sp.（泛氏菌），Tetragenococcus halophilus（嗜盐四联球菌），Tetragenococcus sp.（四联球菌属）。6.采用PCR-DGGE技术对整个酱油发酵过程微生物群落结构的演变规律进行了分析。不同的发酵时期有不同的微生物菌落结构。魏斯菌属从成曲到发酵期结束显现的菌群优势一直很明显；类肠膜魏斯氏菌，发酵乳杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，肠杆菌属，它们的数量随发酵时间的增长而有逐渐减少的趋势；嗜盐四联球菌和一种不可培养的细菌，在进入发酵期后才出现，并且菌群优势有增强的趋势；其余8个菌种进入发酵期就逐渐死亡。因此，整个酱油发酵过程微生物群落结构的演变规律是由复杂到简单。并且此微生物群落的变化规律与氨基态氮、总酸、NaCl含量、pH值随发酵时间的变化规律具有一定的相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景和意义
• 1.2 酱油生产用菌种及主要微生物
• 1.2.1 米曲霉（Aspergillus oryzae）
• 1.2.2 酵母菌
• 1.2.3 乳酸菌
• 1.3 国内外研究现状
• 1.4 微生物研究方法介绍
• 1.4.1 传统的微生物研究方法
• 1.4.2 BIOLOG 微平板法
• 1.4.3 磷脂脂肪酸法
• 1.4.4 分子生物学方法
• 1.5 变性梯度电泳（DGGE）技术
• 1.5.1 PCR-DGGE技术基本原理
• 1.5.2 PCR-DGGE方法的优缺点
• 1.5.3 DGGE技术在传统发酵食品中的应用
• 1.6 本文的研究目的和主要内容
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究内容
• 第二章 酱油发酵过程理化性质分析
• 引言
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 氨基态氮的测定方法
• 2.2.2 总酸的测定方法
• 2.2.3 食盐 NaCl 含量的测定方法
• 2.2.4 pH 值的测定方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 氨基态氮随发酵时间的变化
• 2.3.2 总酸及pH 值随发酵时间的变化
• 2.3.3 食盐含量随发酵时间的变化
• 2.4 本章小结
• 第三章 基因组总DNA提取及PCR扩增
• 引言
• 3.1 材料与设备
• 3.1.1 样品采集
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 样品预处理
• 3.2.2 DNA 提取方法
• 3.2.3 PCR-DGGE引物序列
• 3.2.4 Touch-down PCR体系、程序优化
• 3.2.5 琼脂糖电泳
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 总DNA 提取方法的检测
• 3.3.2 DNA模板量对PCR 结果的影响
• 3.3.3 退火温度对PCR 结果的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 酱油发酵过程微生物的DGGE指纹图谱分析及多样性评价
• 引言
• 4.1 材料与设备
• 4.1.1 样品采集
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 仪器设备
• 4.1.4 试剂配制
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 总DNA 提取
• 4.2.2 PCR-DGGE 引物序列
• 4.2.3 基因组DNA 的PCR 扩增
• 4.2.4 PCR 产物纯化
• 4.2.5 变性梯度凝胶电泳及图谱分析
• 4.2.6 切胶测序和系统发育分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 16S rDNA V3 片段的扩增
• 4.3.2 DGGE 电泳条件的优化
• 4.3.3 DGGE 指纹图谱分析
• 4.3.4 测序结果及分析
• 4.4 本章小结
• 结论及展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢