产ESBLs菌株整合子检测及其与耐药表型的相关性分析

论文摘要

近年来随着抗菌药物在兽医临床上的大量使用，许多病原菌，尤其是ESBLs阳性菌株，广泛产生了多重耐药性，这给兽医临床治疗带来了巨大困难。因此，加强ESBLs阳性菌株耐药机制的研究对指导临床合理用药，有效控制疾病具有重要意义。本研究采用细菌药物敏感性试验方法和PCR检测方法探讨超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和整合子在ESBLs阳性菌株多重耐药性中的作用，以期为进一步阐明ESBLs阳性菌株的耐药机制奠定基础。首先，筛选鉴定了20株ESBLs阳性菌株。采用CLSI推荐的ESBLs初筛和确证试验方法对69株临床分离鉴定的致病性大肠埃希菌和假单胞菌进行ESBLs检测。结果显示69株受试菌中检测出20株ESBLs阳性菌株，检出率为28.99%，其中致病性大肠埃希菌16株、绿脓杆菌3株和恶臭假单胞菌1株。其次，从分子水平检测了整合子在ESBLs阳性菌株中的携带情况。以煮沸法提取的细菌基因组DNA为模板，使用可同时扩增Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合酶基因的简并引物，对ESBLs阳性菌株进行PCR检测，并结合核酸内切酶限制性片段长度多态性分析，确定菌株携带的整合子类型。结果显示20株ESBLs阳性菌株均携带Ⅰ类整合子，此外，YD1、YLN和LN11073株细菌同时携带了Ⅰ类和Ⅱ类整合子，即受试菌中Ⅰ和Ⅱ类整合子的携带率分别为100%和15%。再次，PCR扩增Ⅰ类整合子基因盒插入序列，测序分析了其携带的耐药基因盒。参照Du X D等人设计的Ⅰ类整合子耐药基因盒引物，对20株ESBL整合子阳性菌株进行PCR扩增。将扩增产物克隆至pMD-18T载体多克隆位点构建重组克隆质粒并测序。将测序结果登录GenBank并进行BLAST分析，确认耐药基因盒种类。结果显示20株受试菌中有8株细菌扩增出2种不同的基因盒插入序列，其中JD4菌株携带的Ⅰ类整合子基因盒插入序列长约2315bp，其余7株细菌Ⅰ类整合子基因盒插入序列长约2065bp。两种大小不同的插入基因盒主要含有二氢叶酸还原酶和氨基糖腺苷转移酶两种耐药基因，使细菌呈现对甲氧磺胺嘧啶类及氨基糖苷类抗菌药物的耐药性。最后，对ESBLs、整合子与细菌耐药表型三者间相关性进行了分析。采用K-B纸片琼脂扩散法测定临床分离的69株致病菌的耐药性，使用统计学方法比较分析ESBLs整合子阳性菌株与阴性菌株之间、携带耐药基因盒的ESBLs整合子阳性菌株与不携带耐药基因盒的ESBLs整合子阳性菌株之间的耐药率有无差异。结果显示ESBLs整合子阳性菌株的耐药率明显高于非ESBLs整合子阴性菌株，二者呈明显差异性（P<0.01），但携带耐药基因盒的ESBLs整合子阳性菌株与不携带耐药基因盒的整合子阳性菌株的耐药率无明显差异性。综上所述，本研究从临床分离的69株致病菌中筛选鉴定到20株ESBLs阳性菌株。受试ESBLs阳性菌株中Ⅰ和Ⅱ类整合子的携带率分别为100%和15%。ESBLs整合子阳性菌株的耐药率明显高于非ESBLs整合子阴性菌株，但携带耐药基因盒的ESBLs整合子阳性菌株与不携带耐药基因盒的整合子阳性菌株的耐药率无明显差异性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 主要图表
• 本论文常用中英文缩写词
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验菌株
• 1.2 工程菌与质粒
• 1.3 药敏纸片
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要培养基及溶液的配制
• 1.5.1 水解酪蛋白（MH）培养基
• 1.5.2 Luria-Bertani（LB）培养基
• 1.5.3 含氨苄青霉素（Amp）的 LB 琼脂平板
• 1.5.4 Amp 母液的配制
• 1.5.5 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.5.6 感受态细胞制备及转化用溶液
• 1.6 主要仪器
• 1.7 ESBLs菌株表型筛选试验
• 1.8 ESBLs菌株表型确证试验
• 1.9 ESBLs菌株整合酶基因的PCR扩增与鉴定
• 1.9.1 PCR 扩增模板的制备
• 1.9.2 简并引物的合成
• 1.9.3 整合酶基因的PCR扩增
• 1.9.4 整合酶基因PCR产物的单酶切鉴定
• 1.10 产ESBLs菌株基因盒的PCR扩增与序列分析
• 1.10.1 Ⅰ类整合子基因盒插入序列的 PCR 扩增
• 1.10.2 耐药基因盒序列测定与分析
• 1.11 产ESBLs菌株整合子分布与耐药表型的相关性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ESBLs 阳性菌株检出情况
• 2.2 ESBLs菌整合酶基因的PCR扩增
• 2.3 整合酶基因PCR产物的酶切鉴定
• 2.4 Ⅰ类整合子基因盒插入序列的检测
• 2.5 Ⅰ类整合子基因盒插入序列的测定与分析
• 2.5.1 2065bp基因盒插入序列的分析
• 2.5.2 2315bp片段的基因盒序列分析
• 2.6 产ESBLs菌株整合子分布与耐药表型的相关性分析
• 3 讨论
• 3.1 ESBLs 阳性菌株的危害性
• 3.2 整合子与耐药基因盒的检测方法
• 3.3 ESBLs、整合子与细菌耐药表型三者间的相互关系
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介