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靶向肺癌重组抗体的构建及其体内、外抑瘤实验研究

2020-12-11阅读(963)

靶向肺癌重组抗体的构建及其体内、外抑瘤实验研究

论文摘要

利用基因工程操作技术对抗CEA单链抗体T84.66进行了二硫键改构,设计并人工合成了抗CEA scdsFv基因序列,并通过柔性连接肽将SEA基因序列融合在抗CEAscdsFv末端,此基因序列命名为SC-C/SEA。将上述核苷酸序列克隆入原核表达载体pET28a（+）,构建了原核表达质粒pET-SC-C/SEA。将原核表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,并对诱导时间、IPTG浓度等表达条件进行优化,从而获得目的蛋白SC-C/SEA。利用SDS-PAGE和Western blotting对SC-C/SEA的表达进行了鉴定。利用亲合层析方法对SC-C/SEA进行复性和初步纯化。利用免疫荧光结合流式细胞术分析、MTT等方法探讨了SC-C/SEA对A549细胞的识别和结合能力及其特异性；分析了SC-C/SEA对体外培养的A549细胞增殖的影响；检测了重组蛋白SC-C/SEA对PBMC中CTL功能的作用。实验结果表明,SC-C/SEA可特异性识别A549细胞（CEA阳性）并与之结合,对HeLa细胞（CEA阴性）无此活性。SC-C/SEA对A549细胞的结合活性存在一定的剂量和时间依赖关系,其最佳作用条件为20μl作用4h; SC-C/SEA基本对体外培养的细胞无明显毒性作用；另外,PBMCCTL活性的检测结果表明,SC-C/SEA能够刺激针对A549细胞的特异性CTL反应,且其作用具有一定的效靶比依赖性。本研究利用所构建和表达的重组蛋白SC-C/SEA、SC-C和SEA对肺癌实体肿瘤模型进行探索性治疗研究。结果表明,SC-C/SEA能有效延长肺癌实体模型动物的平均生存期、提高生存几率。另外,SC-C/SEA具有减缓肿瘤组织生长速度的作用。对免疫指标的检测表明,SC-C/SEA能够非特异性的促进某些细胞因子的分泌,且具有刺激增强抗肿瘤CTL和NK活性的作用。

论文目录

  • 内容提要
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 英文缩略词表
  • 绪论
  • 第一篇 文献综述
  • 第1章 癌症的靶向治疗:抗体和免疫结合物的新进展
  • 1.1 非结合抗体的治疗
  • 1.2 免疫结合物
  • 1.3 放射性核素
  • 1.4 药物免疫结合物
  • 1.5 毒物免疫结合物
  • 第2章 肺癌信号通路的发病机制——肺癌治疗的靶标
  • 2.1 肺癌的病因学
  • 2.2 生长刺激信号通路的异常
  • 2.3 肿瘤抑制基因通路的异常
  • 2.4 凋亡逃避
  • 2.5 肺癌的表基因变化
  • 第二篇 研究内容
  • 第1章 重组抗体原核表达质粒的构建
  • 1.1 材料与方法
  • 1.2 结果
  • 1.3 讨论
  • 1.4 小结
  • 第2章 重组抗体在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化
  • 2.1 材料与方法
  • 2.2 结果
  • 2.3 讨论
  • 2.4 小结
  • 第3章 重组抗体对肺癌细胞A549的识别作用研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.2 结果
  • 3.3 讨论
  • 3.4 小结
  • 第4章 重组抗体对肺癌动物模型的抑制作用研究
  • 4.1 材料与方法
  • 4.2 结果
  • 4.3 讨论
  • 4.4 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
  • 致谢

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